La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Xiuchun Ge; Ping Xu

doi:10.3791/4356

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Article de méthode

La délétion de gènes dans le génome entier

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DOI :

10.3791/4356

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23 novembre 2012

Xiuchun Ge¹ , Ping Xu¹

¹The Philips Institute of Oral and Craniofacial Molecular Biology, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

Une échelle du génome unique efficace méthode de mutation du gène a été établie à l'aide Streptococcus sanguinis Comme organisme modèle. Cette méthode a réalisé via PCR à haut débit recombinantes et des transformations.

Résumé

Transposon mutagenèse et un seul gène suppression ya deux méthodes appliquées dans inactivation du gène du génome entier dans ^1,2 bactéries. Bien mutagenèse par transposon prend moins de temps, moins coûteux, et ne nécessite pas l'information du génome terminée, il ya deux faiblesses de cette méthode: (1) la possibilité d'une mutants disparates dans la bibliothèque mixte mutant qui contre-sélectionne les mutants où la concurrence est diminué; et (2) la possibilité d'inactivation partielle de gène par lequel les gènes ne sont pas entièrement perdent leur fonction après l'insertion d'un transposon. Analyse par deletion seul gène peut compenser les inconvénients liés à la mutagenèse par transposon. Pour améliorer l'efficacité de l'ensemble du génome délétion du gène unique, nous essayons de mettre en place une technique à haut débit pour l'ensemble du génome délétion du gène unique à l'aide sanguinis Streptococcus comme organisme modèle. Chaque délétion du gène construire dans S. sanguinis génome est conçu pour comporter 1Kb en amont du gène ciblé, le gène aphA-3, codant pour la protéine de résistance à la kanamycine et le 1-ko aval du gène ciblé. Trois ensembles d'amorces F1/R1, F2/R2 et F3/R3, respectivement, sont conçues et synthétisées dans un format de plaque à 96 puits pour PCR des amplifications de ces trois composantes de chaque suppression construire. R1 et F3 amorces contiennent 25-pb des séquences qui sont complémentaires de régions de la aphA-3 du gène à leur extrémité 5 '. A grande échelle amplification par PCR du gène aphA-3 est effectuée une fois pour toutes les constructions de deletion création d'un seul gène. Le promoteur de gène aphA-3 est initialement exclu de réduire au minimum l'effet potentiel polaire de cassette kanamycine. Pour créer les constructions de deletion du gène à haut débit amplification par PCR et la purification sont effectuées dans un format de plaque à 96 puits. Un amplicon PCR recombinante linéaire pour chaque délétion du gène sera constitué par quatre réactions PCR en utilisant l'ADN polymérase haute fidélité. Le expon initialephase de croissance préférentiel de S. sanguinis cultivées en bouillon Todd Hewitt supplémenté avec 2,5% de sérum de cheval inactivé est utilisé pour augmenter la compétence pour la transformation de la PCR recombinante constructions. Sous cette condition, jusqu'à 20% de S. sanguinis cellules peuvent être transformées en utilisant ~ 50 ng d'ADN. Sur la base de cette approche, 2.048 mutants avec un seul gène de suppression ont finalement été obtenus à partir des gènes chez S. 2270 sanguinis l'exclusion des quatre ORF du gène entièrement contenue dans d'autres ORF de S. SK36 sanguinis et 218 gènes potentiels essentielles. La technique sur la création de constructions de deletion du gène est un débit élevé et pourrait être facile à utiliser dans l'ensemble du génome délétions de gènes uniques pour toutes les bactéries transformables.