Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em> Streptococcus sanguinis</em> Yüksek Verimli PCR ile
Summary
Verimli bir genom tek gen mutasyonu yöntemi kullanılarak oluşturulmuştur<em> Streptococcus sanguinis</em> Bir model organizma olarak. Bu yöntem yüksek verimlilik rekombinant PCR ve dönüşümler yoluyla elde etti.
Abstract
Transposon mutagenez ve tek gen delesyonu bakteriler 1,2 genom gen nakavt uygulanan iki yöntem vardır. Transposon mutagenesis, daha az zaman alan daha az maliyetli ve tamamlanmış genom bilgi gerekli değildir olmasına rağmen, bu yöntem iki zayıf vardır: azalma ile rekabet mutantlar karşı seçer ve bu karışık mutant kütüphanesi içinde bir farklı mutantların (1) olasılığı; ve (2) kısmi gen inaktivasyonu olasılığını sayede genlerin tamamen transposonun yerleştirilmesinin ardından kendi işlevini kaybetmek yok. Tek gen silme analizi transpozon mutasyon ile ilgili dezavantajları telafi edebilir. Genom tek gen delesyonu verimini artırmak için, bir model organizma olarak Streptococcus sanguinis kullanarak genom tek gen delesyonu için yüksek-throughput tekniği kurmaya çalışacaktır. Her gen delesyonu S. inşa sanguinis genom 1 ihtiva şekilde tasarlanmıştırHedefli gen, APHA-3 geni kodlayan, kanamisin e dirençli protein ve hedeflenen gen 1-kb akış aşağı-yukarı kb. Primerler F1/R1, F2/R2, ve F3/R3 üç set, sırasıyla tasarlanmış ve her bir silme, bu üç parçalarını inşa PCR büyütmesi için-96-kuyucuklu bir plaka biçiminde sentezlenir. Primerler, R1 ve F3 kendi 5 'ucunda APHA-3 gen bölgeleri için tamamlayıcı olan 25-bp sekanslar içerir. APHA-3 geninin büyük ölçekli bir PCR amplifikasyon tüm tek gen silme yapıları oluşturmak için bir kez gerçekleştirilir. APHA-3 geninin promotörü başlangıçta kanamisin kaseti potansiyel kutup etkisini en aza indirmek için dahil edilir. Gen silme yapıları oluşturmak için yüksek verimli, PCR saflaştırma 96 çukurlu bir levha formatında gerçekleştirilir. Her gen delesyonu için doğrusal bir rekombinant PCR amplikon yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılarak dört PCR reaksiyonları aracılığıyla yapılacaktır. Ilk exponS. ential büyüme fazı % 2.5 inaktive at serumu PCR-rekombinant yapıların dönüşümü için yeteneklerini artırmak için kullanılan Todd Hewitt broth kültürü sanguinis desteklenmiştir. S. Bu koşul altında,% 20'ye kadar sanguinis hücrelerin DNA ~ 50 ng kullanılarak dönüştürülebilir. Bu yaklaşıma göre, tek gen silinmesi ile 2.048 nihai mutant S. 2.270 genler elde edildi dört gen ORF hariç sanguinis S. başka ORF tamamen kaplayabilir sanguinis SK36 ve 218 potansiyel elzem genler. Gen delesyonu yapıları oluşturma konusunda teknik, yüksek verim ve herhangi bir dönüştürülebilir bakteri genomu tek gen delesyonlar kullanımı kolay olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İlk astar tasarımı sırasında komşu genler üzerinde dışsal antibiyotik gen ile bir hedef genin değiştirilmesi mümkün polar etkilerini en aza indirmek için, iki adım alınır. Silinen genlerin çoğu için, primerler R1 ve F3 önce stop kodonu ile 30 bp için başlangıç kodonu takip eden 6 bp gelen kodlama bölgesindeki silmek için tasarlanmıştır. Son 30 baz çifti bitişik aşağı gen tarafından kullanılan potansiyel ribozomal bağlanma yeri korumak için korunur. Iki komşu genler arasında…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Virginia Commonwealth Üniversitesi Başkanlık Araştırma Teşvik Programı (PRIP) 144602-3 (PX) tarafından, Sağlık (PX) Ulusal Enstitüleri ile hibe R01DE018138 tarafından kısmen desteklenmiştir. Biz Dr teşekkür ederim. Lei Chen, genom çapında mutantların inşaatı ile yardım için Yuetan Dou ve Wang Xiaojing. Biz de DNA dizi için Virginia Commonwealth Üniversitesi'nde DNA Çekirdek Tesis ederim.
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3’5″-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
