RNA-seq Analisi trascrittomi in trombina-trattati e di controllo dell'uomo polmonari cellule endoteliali microvascolari
Summary
Questo protocollo presenta una procedura completa e dettagliata di applicare RNA-seq, una potente tecnologia di nuova generazione di sequenziamento del DNA, per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo è generalizzabile a varie cellule o tessuti colpiti da diversi reagenti o stati di malattia.
Abstract
La caratterizzazione di espressione genica in cellule attraverso la misurazione dei livelli di mRNA è uno strumento utile nel determinare come la macchina di trascrizione della cellula è influenzata da segnali esterni (per esempio trattamento di droga), o come cellule differiscono tra uno stato di salute e di uno stato di malattia. Con l'avvento e il perfezionamento continuo della prossima generazione di tecnologia di sequenziamento del DNA, RNA-sequenziamento (RNA-seq) è diventato un metodo sempre più popolare di analisi del trascrittoma di catalogare tutte le specie di trascrizioni, per determinare la struttura della trascrizione di tutti i geni espressi e di quantificare i livelli di espressione di cambiamento del set totale di trascritti in un dato 1,2 cellula, tessuto o organismo. RNA-seq sostituisce progressivamente DNA microarrays come metodo preferito per l'analisi del trascrittoma perché ha i vantaggi di una profilatura transcriptome completa, fornendo un tipo di dato digitale (numero di copie di ogni trascrizione) e non basandosi su qualsiasi sequen genomica notace 3.
Qui vi presentiamo un protocollo completo e dettagliato di applicare RNA-seq per trascrittomi profilo in umano cellule endoteliali microvascolari polmonari con o senza trattamento trombina. Questo protocollo si basa sul nostro recente studio pubblicato dal titolo "RNA-Seq rivela trascrittoma Romanzo di geni e loro isoforme umane in cellule endoteliali microvascolari polmonari trattati con trombina," 4 in cui abbiamo effettuato con successo la prima analisi completa del trascrittoma umane polmonari cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina utilizzando RNA-seq. Ha prodotto le risorse senza precedenti per la sperimentazione ulteriore di acquisire conoscenze sui meccanismi molecolari alla base di trombina-mediata disfunzione endoteliale nella patogenesi di condizioni infiammatorie, il cancro, il diabete e le malattie cardiache coronariche, e fornisce nuovi indizi per potenziali bersagli terapeutici per queste malattie.
Il testo descrittivo di questo protocolloè diviso in quattro parti. La prima parte descrive il trattamento di polmonari umane cellule endoteliali microvascolari con trombina e isolamento dell'RNA, analisi della qualità e quantificazione. La seconda parte descrive la costruzione della libreria e sequenziamento. La terza parte descrive l'analisi dei dati. La quarta parte descrive una RT-PCR convalida. I risultati rappresentativi di diversi passaggi chiave vengono visualizzati. Consigli utili o precauzioni per aumentare il successo in passaggi chiave sono forniti nella sezione di discussione. Sebbene questo protocollo utilizza polmonari umane cellule endoteliali microvascolari trattate con trombina, può essere generalizzato a trascrittomi profilo sia nelle cellule di mammiferi e non mammiferi e nei tessuti trattati con differenti stimoli o inibitori, o per confrontare trascrittomi in cellule o tessuti tra uno stato di salute e uno stato di malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi chiave
Manipolazione di RNA: RNasi peggiora anche i più di alta qualità RNA, pertanto è necessario prestare attenzione durante l'isolamento, lo stoccaggio e l'uso di RNA 10. I guanti sono sempre indossati per prevenire la contaminazione da RNasi presenti sulle mani umane. I guanti devono essere cambiati spesso, in particolare dopo la pelle toccare, maniglie delle porte o altre superfici comuni. Una serie di pipette deve essere dedicato esclusivame…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Stephen Kingsmore e il Pediatric Medicine Center Genome presso Ospedali Mercy bambini e cliniche per l'uso dei loro cluster di calcolo per l'analisi dei dati, il campo Illumina di assistenza tecnica (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e tecnica team di consulenti per le loro risposte rapide e suggerimenti utili sul funzionamento dello strumento di prossima generazione di sequenziamento del DNA, HiScanSQ, e la qualità dei dati di analisi. Questo lavoro è stato in parte finanziato dal National Institutes of Health di Grant HL080042 (a SQY) e start-up fondo di dotazione e degli Ospedali Mercy bambini e Cliniche, Università del Missouri a Kansas City (a SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
References
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