RNA-seq Analyse av Transcriptomes i Thrombin-behandlet og Kontroll Menneskelig Pulmonal mikrovaskulær endotelceller
Summary
Denne protokollen presenterer en komplett og detaljert fremgangsmåte for å søke RNA-seq, en kraftig neste generasjons DNA-sekvensering teknologi, å profilere transcriptomes i menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller med eller uten trombin behandling. Denne protokollen er generalizable til ulike celler eller vev som påvirkes av ulike reagenser eller sykdom stater.
Abstract
Karakterisering av genuttrykk i celler via måling av mRNA er et nyttig verktøy for å bestemme hvordan transcriptional maskineri av cellen blir påvirket av eksterne signaler (f.eks medikamentell behandling), eller hvordan cellene skiller mellom en sunn tilstand og en syk tilstand. Med advent og kontinuerlig forbedring av neste generasjons DNA-sekvensering teknologi, har RNA-sekvensering (RNA-seq) blitt en stadig mer populær metode for transkriptom analyse for å katalogisere alle arter av vitnemål, for å fastslå transcriptional strukturen av alle uttrykte gener og å kvantifisere skiftende uttrykket nivåer av den totale sett av transkripsjoner i en gitt celle, vev eller organisme 1,2. RNA-seq gradvis erstatte DNA mikromatriser som en foretrukket metode for transkriptom analyse fordi den har fordelene ved profilering en komplett transkriptom, gir en digital type datum (kopitall av enhver transkripsjon) og ikke stole på noen kjent genomisk Sekvensce 3.
Her presenterer vi en komplett og detaljert protokoll for å bruke RNA-seq til profilen transcriptomes i menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller med eller uten trombin behandling. Denne protokollen er basert på vår siste publiserte studien med tittelen "RNA-seq avslører Novel transkriptom av gener og deres isoformer i Human Pulmonal mikrovaskulær endotelceller behandlet med trombin," 4 der vi vellykket utført den første komplette transkriptom analyse av menneskelige lunge mikrovaskulære endotelceller behandlet med trombin ved hjelp RNA-seq. Det ga enestående ressurser for videre eksperimentering for å få innsikt i molekylære mekanismene bak trombin-mediert endotelial dysfunksjon i patogenesen av inflammatoriske tilstander, kreft, diabetes, og koronar hjertesykdom, og gir potensielle nye kunder for terapeutiske mål på disse sykdommene.
Den beskrivende teksten av denne protokollener delt i fire deler. Den første delen beskriver behandling av humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller med trombin og RNA isolering, kvalitet analyse og kvantifisering. Den andre delen beskriver bibliotek konstruksjon og sekvensering. Den tredje delen beskriver dataanalyse. Den fjerde delen beskriver en RT-PCR validering analysen. Representative resultater av flere viktige trinnene vises. Nyttige tips eller forholdsregler for å øke suksess i viktige skritt er gitt i diskusjonen delen. Selv om denne protokollen bruker humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller behandlet med trombin, kan det bli generalisert til profilen transcriptomes i både pattedyr og ikke-pattedyr celler og i vev behandlet med forskjellige stimuli eller inhibitorer eller til sammenligningen transcriptomes i celler eller vev mellom en sunn tilstand og en sykdomstilstand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktige skritt
RNA Håndtering: RNases vil forringe selv de mest høy kvalitet RNA, og derfor må tas i løpet av isolasjon, lagring og bruk av RNA 10. Hansker er alltid slitt for å hindre forurensning av RNases funnet på menneskehender. Hansker bør skiftes ofte, spesielt etter å berøre huden, doorknobs eller andre vanlige overflater. Et sett av pipetter skal være dedikert utelukkende til RNA arbeid og alle tips og rør bør være RNase-frie. RNA isolering og n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke dr. Stephen Kingsmore og Pediatric Genome Medicine Center på Barnas Mercy Sykehus og klinikker for bruk av deres databehandling klynger for våre data analyse, Illumina er felt service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook og Mark Cook) og teknisk konsulent team for sine raske svar og nyttige forslag om driften av neste generasjon DNA-sekvensering instrument, HiScanSQ, og datakvalitet analyse. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health Grant HL080042 (til SQY) og oppstart fond og legat av barns Mercy Sykehus og klinikker, University of Missouri i Kansas City (til SQY).
Materials
| Reagents or Equipments | Company | Catalog number | Comments |
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2815 | |
| Lonza, Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | Contains EGM-2, FBS, growth factors and antibiotics |
| Thrombin | Sigma | T4393 | |
| Ambion mirVana Kit | Life Technologies | AM 1560 | |
| RNase-Zap | Life Technologies | AM9782 | |
| Experion StdSens RNA | Bio-Rad | 700-7103 | |
| TruSeq RNA Preparation Kit | Illumina | FC-122-1001 | |
| AMPureXP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Superscript Reverse Transcriptase II | Life Technologies | 18064-014 | |
| Experion DNA 1K | Bio-Rad | 700-7107 | |
| QuantiTect SyberGreen | Qiagen | 204163 | |
| PE Cluster Generation Kit | Illumina | PE-401-3001 | |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC110-301 | |
| 200 Cycle SBS Kit | Illumina | FC-401-3001 | |
| HiScanSQ* | Illumina | SY-103-2001 | |
| cBot | Illumina | SY-301-2002 | |
| qPCR machine – Viia7 | Life Technologies | Model #VIIA7 / Equipment #10631261 | Or equivalent |
| Experion System | Bio Rad | 7007001 | Bioanalyzer is an alternative system |
| Spectrophotometer | Bio-Tek | Epoch Microplate Spectrophotometer | Or equivalent |
| Centrifuge – Sorvall Legend XTR | Thermo Scientific | 75004521 | Or equivalent |
| Magnetic stand | Life Technologies | AM10027 | |
| 96-well thermocycler | General Lab Supplier | ||
| Table 3. List of Key Reagents and Major Equipment. *, In the video, HiSeq1000 instead of HiScanSQ was demonstrated. |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
- Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229 (2012).
- Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25 (2009).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
- Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).
- Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
- Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
- Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
- Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).
