את פרטי מאמר פרוטוקול transfection ספציפי לאתר של מקושקש רצף של siRNA בתרבית תאי יונקים חסידה באמצעות מערך microelectrode (MEA).
הגילוי של מסלול RNAi באאוקריוטים והפיתוח הבא של סוכני RNAi, כגון siRNA וshRNA, השיג שיטה רבה עצמה להשתקת גנים מסוימים 1-8 לגנומיקה ותרופות תפקודיות. אתגר גדול המעורבים במחקרים מבוססים RNAi הוא המסירה של סוכני RNAi לתאים ממוקדים. טכניקות מסורתיות שאינן נגיפיות משלוח, כגון electroporation בתפזורת ושיטות transfection כימיים לעתים קרובות חוסר השליטה במרחב הנחוצה על משלוח ולהרשות יעילות transfection עניה 9-12. התקדמות בשיטות transfection כימיות כגון שומני קטיוני, פולימרי קטיוני חלקיקים הביאה ליעילות transfection משופרת מאוד 13. עם זאת, שיטות אלו עדיין לא הצליחו להציע שליטה מרחבית מדויקת במסירה שמאוד יכולים להועיל מיניאטורי טכנולוגיות תפוקה גבוהה, מחקרי תא בודדים וחקירות של אינטראקציות תא סלולרי.
nt "> ההתקדמות טכנולוגית האחרונה במסירת הגן אפשר transfection תפוקה גבוהה של תאי חסיד 14-23, רובם משתמשים electroporation microscale. electroporation microscale מציע שליטה זמנית spatio מדויקת במסירה (עד תאים בודדים) והוכח כדי להשיג יעילות גבוהה, 19 24-26. בנוסף, גישות מבוססות electroporation אינן דורשות תקופה ממושכת של דגירה (בדרך כלל 4 שעות) עם קומפלקסי siRNA וה-DNA לפי צורך בשיטות transfection מבוססות כימיות ולגרום לכניסה ישירה של siRNA וDNA עירום מולקולות לתוך הציטופלסמה התא. כביטוי גני תוצאה יכולות להיות מושגת כבר בשש שעות לאחר transfection 27. המעבדה שלנו הוכיחה את השימוש במערכי microelectrode (MEA) עבור transfection אתר ספציפי בתרביות של תאי יונקי חסיד 17-19 בעבר. בגישה המבוססת MEA, מסירת המטען גנטי מושגת באמצעות electroporati המקומי מייקרו בקנה מידהבתאים. יישום של פולס חשמלי לאלקטרודות נבחרת יוצר שדה חשמלי מקומי שמוביל לelectroporation נוכחיים בתאים באזור של אלקטרודות מגורה. השליטה העצמאית של אלקטרודות מייקרו מספקת שליטת מרחב ובזמן על transfection וגם מאפשרת ניסויים מבוססים transfection מרובים להתבצע על אותה תרבות הגדלת התפוקה וההפחתה הניסיונית השתנות תרבות לתרבות.כאן אנו מתארים התקנה הניסיונית ופרוטוקול transfection הממוקד של תאי הלה חסיד עם siRNA מתויג fluorescently מקושקש רצף באמצעות electroporation. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם עבור transfection של וקטורי פלסמיד. בנוסף, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להרחיב בקלות למגוון רחב של שורות תאי יונקים עם שינויים קלים. זמינות מסחרית של MEAs עם דפוסים אלקטרודה מראש מוגדרים והן מותאמים אישית להפוך לא נגיש טכניקה זומעבדות o רוב המחקר עם ציוד תרבית תאים בסיסי.
במאמר זה וידאו שמדגימים את שימוש MEA לtransfection אתר ספציפי של תאי הלה עם מקושקש רצף של siRNA. אחד היתרונות של טכנולוגיה זו היא תחולתו לשורות תאים שונות, כוללים שורות תאים ראשוניות. המעבדה שלנו הוכיחה בעבר את השימוש בטכנולוגיה זו לtransfection אתר ספציפי של התרבות העצבית ביפוקמפוס…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |