בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)
Summary
Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.
Abstract
fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם 1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל 3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment 4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת 5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic 9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment 10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה 11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) 13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs 9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון 16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית 11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר יצחק וOschry ד"ר אורית שגיאה, אסיף על עזרו במיון FACS. מחקר זה נתמך על ידי מענקים לNE מהתכנית השביעית של האיחוד האירופית Framework (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק n ° [276890], מהמלחמה בסרטן האגוד (# 20110078), ומישראל לחקר הסרטן בקרן (המחקר פרס פיתוח קריירה).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
