Выделение нормальных и раковых связанных Фибробласты из свежих тканей флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS)
Summary
Рак Associated фибробластов (CAFS) содействие раковых клеток, рост и прогрессию через понять, что способствует пролиферации, ангиогенеза и воспаления. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать чистые популяции нормальных фибробластов и CAFS из свежих мышиных и человеческих тканей сортировки клеток, используя PDGFRα как поверхность маркером.
Abstract
Рак связанных фибробластов (CAFS) являются наиболее видных типа клеток в опухоли стромы многих видов рака, в частности рака молочной железы, и их заметное присутствие часто ассоциируется с плохим прогнозом 1,2. CAFS являются активированный субпопуляции стромальных фибробластов, многие из которых выражают миофибробластов маркера α-SMA 3. CAFS происходят из местных фибробластов ткани, а также из костного мозга клеток, полученных работу в развивающиеся опухоли и принять фенотип CAF под влиянием микроокружения опухоли 4. CAFS были показаны для облегчения раковых клеток, рост и прогрессию через сигнализацию, которая способствует пролиферации опухолевых клеток, ангиогенез, и вторжение 5-8. Мы показали, что CAFS повышения роста опухоли посреднические опухоли, способствующих образованию воспалений, начиная с самой ранней предварительной стадии опухолевого 9. Несмотря на растущие доказательства из ключевых CAFS роль играет в обеспечении роста опухоли,изучение CAFS была текущие проблемы в связи с отсутствием CAF-специфических маркеров и подавляющее неоднородность этих клеток, при этом многие подтипы сосуществующих в опухоли микроокружения 10. Кроме того, изучение фибробластов в пробирке затруднено тем, что их профиль экспрессии генов часто изменен в культуре ткани 11,12. Чтобы решить эту проблему и обеспечить беспристрастный профилирования экспрессии генов фибробластов из свежей мыши и тканей человека, мы разработали метод, основанный на предыдущих протоколов для флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) 13,14. Наш подход основан на использовании PDGFRα как поверхностный маркер, чтобы изолировать фибробласты из свежих мышиных и человеческих тканей. PDGFRα обильно выражается как нормальные фибробласты и CAFS 9,15. Этот метод позволяет выделения чистых популяций нормальные фибробласты и CAFS, в том числе, но не ограничиваясь α-SMA + активированный миофибробласты. Изолированные фибробласты могут бытьиспользуется для описания и сравнения эволюции экспрессии генов, которая происходит в течение CAFS опухолей. В самом деле, мы и другие сообщили профиля экспрессии фибробластов выделяют сортировки клеток 16. Этот протокол был успешно проведен, чтобы изолировать и профилю высоко обогащенного популяции фибробластов из кожи, молочной железы, поджелудочной железы и легких тканей. Кроме того, наш метод позволяет также культивирование отсортированных клеток, в целях выполнения функциональных экспериментов и, чтобы избежать загрязнения опухолевыми клетками, которые часто большим препятствием при попытках культуры CAFS.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как эксперименты, проведенные в культуре тканей может быть информативным и функциональным предложить принципы, которые могут быть проверены в живом организме, как известно, большие изменения происходят в экспрессии генов клеток в культуре 11,12. Для того чтобы избе?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Ицхак Oschry и доктора Орит Sagi-Асиф за помощь в сортировке FACS. Это исследование было поддержано грантами на северо-восток от Европейского Союза Седьмой Рамочной Программы (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения N ° [276890], из Израиля Cancer Association (# 20110078), а из Израиля Cancer Research Fund (исследований Развитие карьеры Award).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
