Isolering av normala och cancer-associerade fibroblaster från färska vävnader genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
Summary
Cancer associerade Fibroblaster (CAFS) underlätta tumörinitiering, tillväxt och progression genom signalering som främjar proliferation, angiogenes och inflammation. Här beskriver vi en metod för att isolera rena populationer av normala fibroblaster och CAFS från färsk mus och humana vävnader genom cellsortering med användning PDGFRα som en ytmarkör.
Abstract
Cancer-associerade fibroblaster (CAFS) är den mest framträdande celltypen i tumörstroma av många cancerformer, i synnerhet bröstcancer, och deras framträdande närvaro är ofta förknippad med dålig prognos 1,2. CAFS är en aktiverad subpopulation av stromala fibroblaster, av vilka många uttrycker myofibroblast markören α-SMA 3. CAFS härrör från lokala vävnad fibroblaster samt från benmärgshärledda celler rekryteras till utvecklingsländerna tumören och anta en CAF fenotyp under påverkan av tumören mikromiljön 4. CAFS visade att underlätta tumörinitiering, tillväxt och progression genom signalering som främjar tumörcellsproliferation, angiogenes och invasion 5-8. Vi visade att caféer ökar tumörtillväxt genom att förmedla tumör de främjar inflammation, med början tidigast preneoplastiska steg 9. Trots allt fler bevis på den nyckelroll caféer spela för att underlätta tumörtillväxt,studerar CAFS har varit en pågående utmaning på grund av bristen på CAF-specifika markörer och den stora heterogeniteten hos dessa celler, med många subtyper samexisterande i tumören mikromiljön 10. Dessutom studerar fibroblaster in vitro hindras av det faktum att deras genuttryck profil ofta förändras i vävnadsodling 11,12. För att lösa detta problem och för att möjliggöra opartiska profilering av genuttryck hos fibroblaster från frisk mus och mänskliga vävnader, utvecklade vi en metod som bygger på tidigare protokoll för fluorescens-cellsortering (FACS) 13,14. Vår strategi bygger på att utnyttja PDGFRα som en yta markör för att isolera fibroblaster från färsk mus och mänsklig vävnad. PDGFRα är rikligt uttrycks av både normala fibroblaster och CAFS 9,15. Denna metod medger isolering av rena populationer av normala fibroblaster och CAFS, inklusive, men inte begränsat till α-SMA + aktiverat myofibroblaster. Isolerade fibroblaster kan sedananvänds för karakterisering och jämförelse av utvecklingen av genuttryck som sker i caféer under tumörbildning. Faktum rapporterade vi och andra uttryck profilering av fibroblaster isolerade genom cellsortering 16. Detta protokoll framgångsrikt utförts för att isolera och profilera höganrikat populationer av fibroblaster från hud, bröst, bukspottkörtel och lungvävnad. Dessutom kan vår metod även odling av sorterade celler, för att utföra funktionella experiment och för att undvika kontaminering av tumörceller, vilket ofta är ett stort hinder när man försöker att odla CAFS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan experiment utförda i vävnadskultur kan vara informativ och föreslå funktionella principer som kan verifieras in vivo, är det känt att stora förändringar i genuttryck av celler i kultur 11,12. För att undvika ett steg vävnadsodling vid profilering av genuttryck i fibroblaster, utvecklade vi ett protokoll som gör det möjligt isolering av normala, liksom cancer-associerade fibroblaster från färsk mus eller mänsklig vävnad. Detta protokoll var framgångsrikt tillämpats med hud, buk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Yitzchak Oschry och Dr Orit Sagi-Asif för deras hjälp med FACS sortering. Denna forskning har finansierats med bidrag till NE från Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr [276890] från Israel Cancer Association (# 20.110.078), och från Israel Cancer Research Fund (forskning Karriärutveckling utmärkelse).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Collagenase II | Worthington | LS4176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | Worthington | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| Cell strainer 70 μm | SPL | 93070 | |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Via probe (7AAD) | e-Bioscience | 00-6993-50 | |
| Anti-mouse CD140a-PE (PDGFRa) | e-Bioscience | 12-1401-81 | |
| Anti-mouse F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w/o Phenol Red | Gibco | 31053 | |
| Collagen Type I | BD Biosciences | 354236 |
References
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors. Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).
- Ostman, A., Augsten, M. Cancer-associated fibroblasts and tumor growth–bystanders turning into key players. Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).
- Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).
- Neumann, E., et al. Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis research & therapy. 12, R83 .
- Sherr, C. J., DePinho, R. A. Cellular senescence: mitotic clock or culture shock. Cell. 102, 407-410 (2000).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).
- Pahler, J. C., et al. Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response. Neoplasia. 10, 329-340 (2008).
- Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting. PLoS Med. 5, e19 (2008).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Xouri, G., Christian, S. Origin and function of tumor stroma fibroblasts. Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).
