انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني
Summary
ووصف هو عملية وضع العلامات على مرحلتين باستخدام β-ناقلة الغلوكوزيل (β-GT) لنقل أزيد من الغلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5، تليها الكيمياء اضغط هنا لرابط نقل البيوتين لتخصيب سهلة وكثافة مستقلة. هذه الطريقة فعالة ووضع العلامات المحددة تمكن من مؤسسة حمد الطبية تخصيب-5 مع خلفية منخفضة للغاية وعالية الإنتاجية عن طريق رسم الخرائط epigenomic الجيل القادم التسلسل.
Abstract
5-ميثيل سيتوزين (5-MC) ~ يشكل 2-8٪ من إجمالي cytosines في الحمض النووي الجيني الإنسان ويؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، وصيانة سلامة الجينوم، يطبع الوالدين، تعطيل كروموسوم X-، وتنظيم التنمية، والشيخوخة، والسرطان 1. مؤخرا، تم اكتشاف وجود MC-5 أكسدة، 5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية)، في خلايا الثدييات، وخاصة في الخلايا الجنينية (ES) والخلايا العصبية الجذعية 2-4. يتم إنشاء مؤسسة حمد الطبية من قبل 5-5-أكسدة MC يحفزه TET الأسرة الحديد (II) / α-كيتوغلوتارات التي تعتمد على dioxygenases 2، 3. ويقترح 5-مؤسسة حمد الطبية للمشاركة في الحفاظ على الخلايا الجنينية (MES) الجذعية، تكون الدم العادي والأورام الخبيثة، واقحة التنمية 2، 5-10. من أجل فهم أفضل وظيفة مؤسسة حمد الطبية-5، وهو نظام التسلسل موثوق بها ومباشرة أمر ضروري. يمكن التسلسل بيسلفيت التقليدية لا يميز مؤسسة حمد الطبية 5-5-MC من 11 </sup>. لكشف من مؤسسة حمد الطبية البيولوجيا-5، وضعنا نهجا الكيميائية كفاءة عالية وانتقائية لتسمية والتقاط 5-مؤسسة حمد الطبية، والاستفادة من انزيم عاثية يضيف شاردة الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية على وجه التحديد-5 12.
نحن هنا وصف بسيط من خطوتين الداخلي لوضع العلامات الكيميائية الانتقائي لمؤسسة حمد الطبية-5. في خطوة وضع العلامات الأولى، هو المسمى في مؤسسة حمد الطبية 5-DNA الجيني مع حفز-6-أزيد من الجلوكوز GT-β، وهو من ناقلة الغلوكوزيل عاثية T4، في الطريقة التي ينقل 6 أزيد-الجلوكوز لمؤسسة حمد الطبية-5 من معدلة العامل المساعد، UDP-6-N3-GLC (6-N3UDPG). في biotinylation الثانية، الخطوة، تم إرفاق رابط ثاني كبريتيد البيوتين إلى مجموعة من الكيمياء أزيد فوق. كل الخطوات هي محددة للغاية وفعالة، مما يؤدي إلى استكمال وضع العلامات بغض النظر عن وفرة من مؤسسة حمد الطبية في المناطق-5 الجينومية وإعطاء خلفية منخفضة للغاية. بعد biotinylation من مؤسسة حمد الطبية-5، ثم يتم شظايا الحمض النووي 5-مؤسسة حمد الطبية المحتوية على انتقائي القبضباستخدام الخرز streptavidin بطريقة الكثافة مستقلة. يمكن استخدام الناتج مؤسسة حمد الطبية 5-التخصيب شظايا الحمض النووي لتحاليل المصب، بما في ذلك الجيل القادم التسلسل.
وضع العلامات لدينا انتقائية وبروتوكول القبض يضفي حساسية عالية، تنطبق على أي مصدر من الحمض النووي الجيني مع الكميات المتوفرة من مؤسسة حمد الطبية 5-متغير / متنوعة. على الرغم من أن الغرض الرئيسي من هذا البروتوكول هو تطبيقه المصب (أي.، الجيل التالي من التسلسل لرسم توزيع 5-مؤسسة حمد الطبية في الجينوم)، وهو متوافق مع جزيء واحد، في الوقت الحقيقي SMRT (DNA) التسلسل، وهو قادرة على تقديم واحدة من قاعدة التسلسل قرار مؤسسة حمد الطبية-5.
Protocol
Discussion
5-hydroxymethylcytosine (5-مؤسسة حمد الطبية) هي التي تم تحديدها مؤخرا الحاضر التعديل جينية في كميات كبيرة في بعض أنواع خلايا الثدييات. طريقة المقدمة هنا هو لتحديد توزيع الجينوم على نطاق مؤسسة حمد الطبية-5. نستخدم عاثية T4-β ناقلة الغلوكوزيل لنقل الجلوكوز إلى شاردة الهندسة يحتوي عل…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (CH GM071440 لوNS051630/MH076090/MH078972 إلى PJ).
Materials
| Name | Company | Catalog # | Comment |
| Reagents | |||
| 5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
| 0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
| 1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
| HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
| DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
| 1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
| Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
| Streptavidin C1 | |||
| Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
| Enzyme | |||
| β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
| Equipment | |||
| Sonication device | Covaris | ||
| Desktop centrifuge | |||
| Water bath | Fisher Scientific | ||
| Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
| NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
| Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
| Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
| Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. , 245-254 (2003).
- Ito, S. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133 (2010).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929-930 (2009).
- Ko, M. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468, 839-843 (2010).
- Koh, K. P. Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).
- Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).
- Wossidlo, M. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nat. Commun. 2, 241 (2011).
- Gu, T. P. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature. 477, 606-610 (2011).
- Dawlaty, M. M. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).
- Huang, Y. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, e8888 (2010).
- Song, C. X. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).
- Pastor, W. A. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473, 394-397 (2011).
- Matarese, F., Pau, C. a. r. r. i. l. l. o. -. d. e. S. a. n. t. a., E, ., Stunnenberg, H. G. 5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block. Mol. Syst. Biol. 7, 562 (2011).
- Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 38, 181 (2010).
- Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes. Biochimie. , (2012).
- Rusmintratip, V., Sowers, L. C. An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).
- Globisch, D. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PLoS One. 5, e15367 (2010).
- Yildirim, O. Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells. Cell. 147, 1498-1510 (2011).
- Szulwach, K. E. Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells. PLoS Genet. 7, e1002154 (2011).
- Szulwach, K. E. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).
