Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

Summary

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Abstract

5-metilcitosina (5-mC) costituisce ~ 2-8% dei cytosines totali in DNA genomico umano e influisce un'ampia gamma di funzioni biologiche, tra l'espressione genica, il mantenimento dell'integrità genomica, imprinting parentale, inattivazione del cromosoma X, regolazione sviluppo, invecchiamento e cancro ^1. Recentemente, la presenza di un ossidato 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), è stato scoperto in cellule di mammifero, in particolare nel staminali embrionali (ES) cellule e cellule neuronali ^2-4. 5-HMC è generato per ossidazione di 5-mC catalizzata da TET famiglia ferro (II) / α-chetoglutarato-dipendente diossigenasi ^{2, 3.} 5-HMC si propone di essere coinvolto nel mantenimento di staminali embrionali (MES) delle cellule, emopoiesi normale e le neoplasie, e zigote sviluppo ^{2, 5-10.} Per capire meglio la funzione di 5-HMC, un sistema di sequenziamento affidabile e semplice è essenziale. Sequenziamento bisolfito tradizionale non è possibile distinguere 5-HMC da 5-MC ¹¹ </sup>. Per svelare la biologia di 5-HMC, abbiamo sviluppato un approccio chimico altamente efficiente e selettivo di etichettare e catturare 5-HMC, approfittando di un enzima batteriofago che aggiunge una frazione di glucosio al 5-HMC specifico ^12.

Qui si descrive una semplice procedura in due fasi per l'etichettatura chimica selettiva di 5-HMC. Nella prima fase di etichettatura, 5-HMC nel DNA genomico viene etichettato con un 6-catalizzata azide-glucosio da β-GT, un glucosiltransferasi dal batteriofago T4, in modo che trasferisce il 6-azide-glucosio al 5-HMC dal modificato cofattore, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Nella seconda fase, biotinilazione, un linker biotina disolfuro è attaccato al gruppo azide dalla chimica click. Entrambe le fasi sono altamente specifici ed efficienti, portando a completare etichettatura indipendentemente l'abbondanza di 5-HMC in regioni genomiche e dando fondo estremamente bassa. Biotinilazione seguito di 5-HMC, i 5-HMC contenenti frammenti di DNA vengono selettivamente catturatiutilizzando perline streptavidina in una densità modo indipendente. La risultante 5-HMC arricchiti frammenti di DNA potrebbe essere utilizzato per analisi a valle, sequenziamento di prossima generazione.

La nostra etichettatura selettiva e il protocollo di acquisizione conferisce elevata sensibilità, applicabile a qualsiasi fonte di DNA genomico con variabili / 5-HMC diverse abbondanze. Anche se lo scopo principale di questo protocollo è la sua applicazione a valle (ad es., Sequenziamento di prossima generazione per tracciare il 5-HMC distribuzione nel genoma), è compatibile con singola molecola, in tempo reale SMRT (DNA) sequenziamento, che è in grado di erogare singola base sequenziamento risoluzione del 5-HMC.

Protocol

1. Frammentazione del DNA genomico Frammento di DNA genomico mediante ultrasuoni ad una vasta dimensione desiderata adatto per il genoma a livello di piattaforma di sequenziamento. (Di solito sonicazione a ~ 300 bp.) Verificare la distribuzione dimensionale del DNA genomico frammentato 1% gel (Figura 1). 2. Estrazione del DNA Determinare le quantità di DNA di partenza in base alla abbondanza di 5-HMC nel DNA genomico. Da…

Discussion

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) è un regalo recentemente identificato modificazione epigenetica in quantità notevoli in alcuni tipi di cellule di mammifero. Il metodo qui presentato è per la determinazione del genoma distribuzione a livello di 5-HMC. Usiamo batteriofago T4 β-glucosil trasferire una porzione multistrato glucosio contenente un gruppo azide sul gruppo ossidrile di 5-HMC. Il gruppo azide può essere chimicamente modificato con biotina per il rilevamento, l'arricchimento di affinità, e sequenziament…

Materials

Name	Company	Catalog #	Comment
			Reagents
5M Sodium chloride (NaCl)	Promega	V4221
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma base (Tris) pH7.5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1M, pH7.4	Invitrogen	15630
Magnesium chloride (MgCl2) 1M	Ambion	AM9530G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate	Click Chemistry Tools	A112P3
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure	Invitrogen	15508-013
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Column	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Streptavidin C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500
UDP-6-N3-glucose	Active Motif	55013
			Enzyme
β-glucosyltransferase (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipment
Sonication device	Covaris
Desktop centrifuge
Water bath	Fisher Scientific
Gel running apparatus	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Magnetic Separation Stand	Promega	Z5342
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen
			Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20).