הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em> בחי</em> שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)
Summary
אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI<sup> 1</sup>.
Abstract
אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / 2 סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה.
תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCG001 פלסמיד להביע Ubp1 סופק באדיבות על ידי רוהאן בייקר בג'ון קרטין בית הספר למחקר רפואי. עבודה זו מומנה על ידי מצעד הפרוט מענק המחקר 1-FY2011, מרץ הפרס פרוט זיל אוקונור Starter Scholar Research # 5 FY20 ואות קריירה של NSF 0746796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
