Single-molecule Imaging van genregulatie<em> In vivo</em> Met behulp van Cotranslational Activering door splitsing (CoTrAC)
Summary
We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC), het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode is gebruikt om de expressie stochastische dynamiek van een transcriptiefactor, de λ repressor CI volgen<sup> 1</sup>.
Abstract
We beschrijven een werkwijze fluorescentiemicroscopie, co-translationele activering door splitsing (CoTrAC) het afbeelden van de productie van eiwitmoleculen in levende cellen met enkele molecule precisie zonder verstoren van het eiwit functionaliteit. Deze methode maakt het mogelijk om het aantal tellen eiwitmoleculen geproduceerd in een cel gedurende opeenvolgende vijf minuten tijdvensters. Het vereist een fluorescentiemicroscoop met laserexcitatie vermogensdichtheid van ~ 0,5 tot 1 kW / cm 2, die voldoende gevoelig enkele fluorescerende eiwit moleculen te detecteren in levende cellen. De fluorescerende reporter in deze methode bestaat uit drie delen: een membraan doelsequentie, een snel rijpen, geel fluorescerend eiwit en protease herkenningssequentie. De reporter wordt translationeel gefuseerd aan de N-terminus van een eiwit van interesse. Cellen worden gekweekt op een temperatuurgeregelde microscooptafel. Elke vijf minuten worden fluorescerende moleculen in cellen belicht (en later counted door analyse fluorescentiebeelden) en vervolgens photobleached zodat alleen nieuw vertaalde eiwitten geteld in de volgende meting.
Fluorescentiebeelden gevolg van deze methode kan worden geanalyseerd door het detecteren van fluorescerende vlekken in elk beeld, het toekennen aan individuele cellen en toewijzen cellen cellijnen. Het aantal eiwitten die binnen een tijdvenster in een bepaalde cel wordt berekend door de geïntegreerde fluorescentie-intensiteit van de spots gemiddelde intensiteit van enkele fluorescerende moleculen. We gebruikten deze methode om expressie te meten in het bereik van 0-45 moleculen in enkele 5 min tijdvensters. Deze methode ons in staat om ruis te meten in de expressie van de repressor CI λ, en vele andere mogelijke toepassingen in systeembiologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De CoTrAC methode kan worden gegeneraliseerd tot de productie van andere eiwitten waar conventionele N-of C-terminale fusies kunnen fluorescent eiwit proteïneactiviteit verstoren meten. De CoTrAC strategie heeft drie unieke voordelen ten opzichte van de huidige methoden. Eerste co-translationele fusie, zodat een molecuul van de fluorescente reporter geproduceerd voor elk molecuul van het eiwit van belang, zodat nauwkeurige telling van eiwitproductie in real time. Anderzijds de membraan gerichte reporter Tsr-Venus maakt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het plasmide pCG001 uiten Ubp1 werd vriendelijk door Rohan Baker op de John Curtin School of Medical Research. Dit werk werd gefinancierd door March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 en NSF LOOPBAAN award 0.746.796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
