遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ></em>開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）
Summary
我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています<sup> 1</sup>。
Abstract
我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。この方法によれば、シーケンシャル、5分の時間枠で、1セル内に産生されるタンパク質分子の数を数えるようになります。それは、生きた細胞内の単一の蛍光タンパク質分子を検出するために十分に敏感である〜0.5から1キロワット/ cm 2のレーザー励起パワー密度を持つ蛍光顕微鏡を必要とします。膜標的化配列、高速熟成、黄色蛍光蛋白質とプロテアーゼ認識配列：このメソッドで使用される蛍光レポーターが3つの部分から成ります。記者が翻訳目的のタンパク質のN末端に融合されています。細胞は、温度制御された顕微鏡ステージ上に成長させられる。 5分おきに、細胞内の蛍光分子（およびそれ以降の共同撮像される蛍光画像を分析することによってunted）、続いて、新しく翻訳されたタンパク質は、次の測定にカウントされるようにphotobleached。
この方法から得られた蛍光画像は、各画像の蛍光スポットを検出し、個々のセルに割り当てること、その後の細胞系譜への細胞を割り当てることによって分析することができます。与えられたセルにタイムウィンドウ内で産生される蛋白質の数は、単一蛍光分子の平均強度によってスポットの統合された蛍光強度を割ることによって計算されます。我々は、単一の5分の時間ウィンドウで0から45分子の範囲内で発現レベルを測定するために、このメソッドを使用していました。この方法は、私たちがλリプレッサーCIの式で騒音を測定するために有効になっており、システム生物学の他の多くの潜在的なアプリケーションを持っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
CoTrAC方法は、従来のN末端またはC末端蛍光タンパク質融合体がタンパク質活性を妨害する可能性のある他のタンパク質の産生を測定することが一般化することができる。 CoTrAC戦略は、現在の方法に比べて3特有の利点があります。まず、共同翻訳融合は蛍光レポーターの1分子がリアルタイムでタンパク質生産の正確なカウントを可能にする、目的のタンパク質の各分子のために生成されるこ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ubp1を発現するプラスミドpCG001は、親切に医学研究のジョン·カーティン学校でロハンベイカーによって提供されました。この作品は、ダイム研究助成1〜2011年度の3月ダイムバジルオコナースターター客員研究賞＃5-FY20とNSFキャリアアワード0746796の行進によって賄われていた。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
References
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