CD19特異的キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞は、私たちのファースト·イン·ヒトの遺伝子治療の臨床試験におけるB細胞悪性腫瘍の治験治療として注入される。我々は、使用して、T細胞の遺伝子改変を記述<em>眠れる森の美女</em>(SB)のデザイナー、CD19 +人工抗原提示細胞上のCD19特異的CARと選択的伝播を紹介するシステム。
臨床グレードのT細胞の効力は、腫瘍関連抗原の上司は、(i)認識(のTAA)、(ii)の注入後、永続性、(ⅲ)の可能性と生物学的製品を設計するために免疫療法と遺伝子治療を組み合わせることによって改善することができます腫瘍微小環境内のエフェクター機能をリサイクルする腫瘍部位への移行の可能性、及び(iv)能力。人間のアプリケーションのために設計さT細胞の遺伝子操作のほとんどのアプローチは、CAR 1-3の安定発現用レトロウイルスやレンチウイルスを用いてきた。それは、生産設備の限られた数から臨床グレードの組換えウイルスの製造とリリースに依存しているので、このアプローチは、現在の適正製造基準(GMP)に準拠していますが、高価になることができます。 DNA種がrecombinの約1/10のコストで臨床グレードに製造することができるので、非ウイルスプラスミドの電気伝達は伝達に魅力代替手段です蟻GMPグレードのウイルス。統合の効率を改善するために、我々は人間のアプリケーション4-8 ビューティー (SB)トランスポゾン及びトランスポザーゼスリーピング適応した。私たちのSBシステムは、目的の遺伝子をコードするトランスポゾン( 例えば第2世代CD19固有のCAR導入遺伝子、CD19RCD28と命名)とTAジヌクレオチドリピートに挿入トランスジーンをトランスポザーゼ( 例えば SB11)9-11から成る2 DNAプラスミドを使用する。遺伝的に改変されたT細胞の臨床的に十分な数を生成するために、我々は、TAA( 例えば CD19)ならびにT細胞の共刺激分子CD86、CD137Lを発現するように改変されたK562由来人工抗原提示細胞(AAPC)(クローン#4)、使用膜結合型インターロイキン(IL)-15(ペプチドが修飾されたIgG4のFc領域に融合)とCD64モノクローナル抗体のロード用(FC-γ受容体1)(mAb)は12のバージョン。本稿では、compliaで行うことができる手順を示しCD19-CAR +ヒト固有のアプリケーションに適したT細胞を生成するためのcGMPとNCE。これは、γ線照射AAPCのあらゆる-7日間の追加(刺激周期)により、安定した組込みの取得後に2つのDNAプラスミド、SBトランスポゾン(CD19RCD28)とSBトランスポザーゼ(SB11)の電気転送同期することによって達成された可溶性組換えヒトIL-2とIL-21の13の存在下で(クローン#4)。典型的には4サイクル(連続培養の28日間)が安定的にCARを発現するT細胞の臨床的に魅力的な番号を生成するために実施されている。製造臨床グレードのCD19特異的T細胞にこの方法論は、末梢血(PB)や臍帯血(UCB)由来のT細胞に適用することができます。さらに、このアプローチはAAPCのCARによって認識のTAA、、の発現と導入CARの特異性を組み合わせることで多様な種類の腫瘍に対するT細胞を生成するために利用することができます。
そのようなpiggyBac 12,19とSBから18,20-22としてトランスポゾン及びトランスポザーゼシステムは、臨床グレードのCARのウイルス媒介形質+ T細胞に代わるものです遺伝子治療への非ウイルス性のアプローチである。 SBは、ヒトの遺伝子治療1,6,23のためにそのポテンシャルに基づいて遺伝子導入系として選ば れた。我々はSBの転位(CARを導入する)とコンプライアンスにおけるTAA特異的T細胞の製造におけるプラットフォーム技術として機能するγ線照射AAPCの再帰的加算(安定CARを発現する遺伝子改変されたT細胞を取得する)の二重の技術を開発第I / II相試験のためのcGMP( 図4)。 γ線照射AAPC上の共培養の28日間(4の7日間刺激サイクル)の後、我々は一般的に人間のアプリケーションに適した少なくとも10〜10遺伝的に改変されたT細胞を生成することができます。必要に応じて、追加の刺激サイクルはtを行うことができるO遺伝子改変されたT細胞の大きい番号を生成します。まして車+ T細胞が必要な場合さらに、エレクトロポレーションおよび伝播へのアプローチは、バック少ないキュベットを採用し、それぞれの先頭にフォワードAAPC上の増殖のその後のラウンドのために数値的に展開し、T細胞のちょうど部分集合を運ぶスケーリングすることができます刺激サイクル。の大半は、エレクトロポレーションおよび注入安定CARを表現するために採取したT細胞を伝播します。 CD4 +およびCD8の伸長は、当社の第2世代CARを発現している+ T細胞は、メモリ/ナイーブ表現型を有する細胞が含まれており、リダイレクトされた特異性の3の特徴を示す。まず、遺伝的に改変されたT細胞は、具体的に、第二に、CD19 +標的を溶解するCD19 +刺激細胞に反応してIFN-γを生産し、第三に、CD19に応答して増殖+フィーダー細胞、車に依存した方法13,18のすべてを。 integrのに我々のアプローチSBシステムから非ウイルス性DNAプラスミドの電気伝達によってCARの導入遺伝子を食べたはPBとUCB由来静止一次T細胞で行うことができる。私たちと他の人は遺伝的に効率的に注入24,25のためのT細胞の臨床的に十分な数を伝播するAAPCとして機能するようにK562細胞を変更しました。 AAPCおよび組織培養環境( 例えば、IL-21の添加)を生成するように変更されましたされている患者及び造血幹細胞移植後の注入のためのCD19特異的T細胞( 表1)13,18 をドナー由来。我々は、CARを生成することができます+コスト、不快感、およびアフェレーシスによってPBからMNCを取得する不便さを回避し、単に静脈穿刺によって得られたPBからT細胞。 MNCの小さな数字からCAR多数+ T細胞を誘導する能力は、特に同種UCB移植後のT細胞を注入するため魅力的です。新生児のドナーのサイズが小さいと匿名性を排除し、再·アクセス後の時点でこの個体を収穫したMNCの限られた数字は、造血との干渉を回避するために、T細胞の製造のための出発物質として使用可能です。製造工程へのさらなる進歩は現在取り扱いを最小限にするために完全に閉じたWAVEバイオリアクターと相まって、高スループットのエレクトロポレーション装置を含めるようにして進められている。集計では、SBとAAPCは、CD19特異的CAR +のcGMPに準拠した代替細胞表面TAAを認識することができる遺伝子改変されたT細胞の大規模な番号を生成するように適合させることができるT細胞を生成するためのプラットフォームをアピールしている。
The authors have nothing to disclose.
著者はSBシステムのヘルプについてAAPCクローン#4および博士ペリーハケット(ミネソタ大学)を生成し、提供する助け博士カール6月(ペンシルバニア大学)に感謝したいと思います。
助成金:がんセンターコアグラント(CA16672); RO1(CA124782、CA120956、CA141303)、R33(CA116127)、P01(CA148600); SPORE(CA136411)、アルバート·J·ウォード財団、バローズ·ウェルカム財団; Gillson Longenbaugh財団、がん予防とテキサスの研究所、CLLのグローバル·リサーチ財団国防総省; Noelan L. Biblerの不動産、ハリー·T Mangurian、ジュニア、白血病の免疫療法のための基金、個人化された癌治療の研究所、白血病とリンパ腫協会、リンパ腫研究財団; MDACCの姉妹機関ネットワーク基金、ミラー財団;氏ハーブシモンズ;夫妻ジョー·H·スケール;氏トーマス·スコット、がん研究のための国立財団、小児がん研究財団、生産Assistancウィリアム·ローレンスとブランシュヒューズ子供財団、セルラーセラピー(PACT)のためのe。
Reagents | Vendor | Catalogue number | |||||||||||||
Reagents | |||||||||||||||
DNA plasmid expressing GFP (pmaxGFP) | Lonza | VPA-1002 (kit) | |||||||||||||
PBS | Sigma | D8537 | |||||||||||||
CliniMACS PBS-EDTA | Miltenyi Biotec | 70026 | |||||||||||||
HyQ RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 | |||||||||||||
Phenol Free RPMI-1640 | Thermo Scientific | SH30605.01 | |||||||||||||
Hyclone Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007003HI | |||||||||||||
GlutaMAX (100x) | Gibco | 3505-061 | |||||||||||||
Ficoll-Paque | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-02 | |||||||||||||
Recombinant human IL-21 | PeproTech | AF-200-21 | |||||||||||||
Recombinant human IL-2 (Proleukin) | Novartis | NDC 65483-116-07 | |||||||||||||
Human T cell Kit (Nucleofector Solution) | Lonza | VPA-1002 | |||||||||||||
CliniMACS CD56 Reagent | Miltenyi | 70206 | |||||||||||||
FITC-conjugated to mouse mAb specific for human CD3 | BD Biosciences | 349201 | |||||||||||||
APC-conjugated to mouse mAb specific for human CD4 | BD Biosciences | 340443 | |||||||||||||
PerCPCy5.5-conjugated to mouse mAb specific for human CD8 | BD Biosciences | 341051 | |||||||||||||
PE-conjugated to F(ab’)2 fragment of goat antibody specific for human Fcγ | Invitrogen | H10104 | |||||||||||||
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |||||||||||||
Disposables | |||||||||||||||
12-well plate | Corning | 3513 | |||||||||||||
T-75 cm2 flask | Corning | 430641 | |||||||||||||
Culture bags | Vue Life | 290C; 750C | |||||||||||||
50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||
Amaxa Nuceleofector II | Lonza | AAB-1001 | |||||||||||||
Cellometer | Nexcelom Bioscience | Cellometer Vision | |||||||||||||
Sorvall Legend RT Centrifuge | Sorvall | 75004377 | |||||||||||||
BD FACS Calibur | BD Biosciences | 342975 | |||||||||||||
Controlled rate freezer | Planer | Kryo 750 | |||||||||||||
Irradiator | CIS bio International | IBL-437 C#09433 | |||||||||||||
Complete Culture Media (CCM) (stored at 4 °C for up to 30 days) Flow Cytometry Buffer (stored at 4 °C for up to 30 days) |