Transgenik farenin ya da viral vektörler, akciğer içinde protein ekspresyonu artırmak için kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler teknik olarak zor, zaman alıcı ve sonuçları etkilemesi hedef dışı etkileri vardır. Bizim protein transfeksiyon protokolü bir lipid tabanlı transfeksiyon reaktif ve düzgün akciğer hücrelerine aktif bir protein sunmak için bir ultra ince Micro kullanır.
Protein ekspresyonu arttırmak araştırmacılar daha önemli biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde 1 o proteinin fonksiyonel rolünü anlamak için olanak sağlar. Akciğerde, bu artan gen ekspresyonu 4 ile proteini düzeylerini yükselten transgenik farenin 2,3 veya viral veya non-viral vektörlerin kullanmaktadır genetik yaklaşımlar, genellikle aracılığıyla elde edilmiştir. Transgenik farenin oluşturmak için pahalı ve zaman alıcıdır ve bir transgen ya da kronik gen ifadesinin rastgele yerleştirilmesi, normal akciğer gelişimi değişmesine neden olur ve bu nedenle modelin 5 yardımcı sınırlayabilir. Koşullu ifade oluşturmak için kullanılır kronik gen 6, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (rtTA) fareler ile ilişkili sorunları ortadan koşullu transgenik, kendiliğinden hava sahası genişleme 7 geliştirmek iken. Transgenik olduğu gibi, viral ve non-viral vektörlerin kullanımı 8 pahalı ve doz-D provoke edebilirBu ependent inflamatuar yanıtları sonuçları 9 yıkmak ve ifade 10 engel. Ayrıca, tekrarlı dozların etkinlik vektör 11,12 geliştirilmiş bağışıklık tepkileri ile sınırlıdır. Araştırmacılar daha az inflamasyon kışkırtmak ve akciğer 13 içinde uzun ifade var adeno-ilişkili viral (AAV) vektörleri geliştiriyoruz.
Β-galaktosidaz kullanarak, doğrudan bir proteini transfeksiyon tekniği kullanılarak, akciğer içinde hızla ve etkin biçimde artıran protein ekspresyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, akciğer dokusu, kendisi içine penetrasyon sağlamak için, bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi 20 ul (Pro-Ject, Bio Pierce) ile saflaştırılmış protein sabit tutar karışımları. Lipozomal proteini karışımı daha sonra, bir Micro (Penn Century, Philadelphia, PA) kullanılarak, trakea ile farelerin akciğerleri içine enjekte edilir. Micro akciğerler boyunca sıvı aerosol güzel bir tüy üretir. Tekniği kullanarakBu hava ve fareler 14. alveoller boyunca enjekte proteinin homojen birikimi göstermiştir. Lipid transfeksiyon teknik etki elde etmek için protein küçük bir miktarının kullanımına olanak sağlamaktadır. Bu aksi takdirde yüksek protein idare tarafından provoke olacağını inflamatuvar yanıt sınırlar. Gerçekten de, bu tekniği kullanarak biz önemli ölçüde akciğer lavajı hücreli 15 etkilemeden akciğerde PP2A etkinliği artırmak mümkün olduğunu yayınladı. Cebine 24 saat sonra alınan hücreli akciğer lavaj kontroller ile karşılaştırılabilir olmuştur (27 ± 31 genel 4 kontrol ± 5 albümin transfekte edilmiş, her grupta N = 6). Ayrıca, transgenik bir model oluşabilir akciğer gelişimsel değişimlerin veya yapısal değişiklikler neden olmadan proteini düzeylerini artırır. Ancak, tekrar yönetimlerin ihtiyacını protein ifadesinde uzun vadeli artar etkilerini inceleyen çalışmalar için bu tekniği daha az elverişli hale getirebilir. Bu durum, özellikle tru olacaktırkısa yarı ömürlü proteinler için e.
Diğer yöntemler üzerinde bu tekniğin avantajı, akciğer dokusunun kendisi içinde protein seviyeleri ve aktivite artışı, üretmesidir. Ayrıca, bu sadece hava yolları içinde kalan karşıt olarak akciğerin en uzak bölgelere nüfuz eder. Hatta tuzlu 15 ile hava lavaging sonra enjektat artan protein aktivitesi ölçüldü. Doku etkinlik analizleri protein hücreleri giriyor ve sadece fare hava boşlukları kalır olmadığını göstermektedir. Bu da fare alveoller ve hava yolları (Şekil 3…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (7R01HL098528-03) ve FAMRI Klinik Yenilikçi Ödülü ile desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |