Protein Transfectie van Mouse Lung
Summary
Transgene muizen of virale vectoren zijn gebruikt om eiwitexpressie te verhogen in de longen. Echter, deze technieken zijn tijdrovend, technisch uitdagend en hebben off-target effecten die resultaten kan verwarren. Onze eiwit transfectie protocol gebruikt een lipide gebaseerde transfectiereagens en een ultrafijne microsprayer om actief eiwit uniform te leveren aan longcellen.
Abstract
Verhogend eiwit expressie kunnen onderzoekers beter inzicht in de functionele rol van dat eiwit in het reguleren van de belangrijkste biologische processen 1. In de longen, dit is doorgaans bereikt door middel van genetische benaderingen transgene muizen 2,3 of virale of niet-virale vectoren die eiwitniveaus verhogen via verhoogde genexpressie 4 gebruiken. Transgene muizen zijn duur en tijdrovend te genereren en de willekeurige insertie van een transgen of chronische genexpressie kan normale longontwikkeling veranderen en hun uit bruikbaarheid van het model 5. Terwijl voorwaardelijke transgenen afwenden problemen met chronische genexpressie 6, omgekeerde tetracycline-gecontroleerde transactivator (rtTA) muizen, die worden gebruikt om voorwaardelijke expressie genereren, ontwikkelen spontaan luchtruim uitbreiding 7. Zoals bij transgene, het gebruik van virale en niet-virale vectoren is duur en 8 kunnen veroorzaken dosis-dependent ontstekingsreacties die beschamen resultaten 9 en expressie 10 belemmeren. Bovendien is de werkzaamheid van herhaalde doses worden beperkt door versterkte immuunreacties op de vector 11,12. Onderzoekers ontwikkelen adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren die minder ontstekingen veroorzaken en hebben meer expressie in de longen 13.
Gebruik β-galactosidase, presenteren we een werkwijze voor het snel en effectief verhogen eiwitexpressie in de longen via een directe eiwit transfectietechniek. Dit protocol combineert een vaste hoeveelheid gezuiverd eiwit met 20 ul van een lipide-gebaseerde transfectie reagens (Pro-Ject, Pierce Bio) te laten binnendringen in het longweefsel zelf. De liposomale eiwitmengsel wordt vervolgens geïnjecteerd in de longen van de muizen via de trachea met een microsprayer (Penn Century, Philadelphia, PA). De microsprayer genereert een fijne pluim van vloeibare aërosol in de longen. Met de techniekwe hebben aangetoond uniforme afzetting van het geïnjecteerde eiwit gedurende de luchtwegen en alveoli van muizen 14. De lipide transfectie techniek maakt gebruik van een kleine hoeveelheid eiwit effect. Dit beperkt de ontstekingsreactie die anders door eiwitrijk administratie zou worden uitgelokt. Inderdaad, deze techniek gepubliceerde we dat we konden PP2A activiteit in de long significant te verhogen zonder de long lavage cellulariteit 15. Long lavage cellulariteit genomen 24 uur na challenge was vergelijkbaar met de controles (27 ± 4 controle versus 31 ± 5 albumine getransfecteerde; N = 6 per groep). Bovendien verhoogt eiwitgehalte en zonder het long ontwikkelingsveranderingen of bouwkundige veranderingen die kunnen optreden in transgene modellen. Echter, de noodzaak voor herhaalde toedieningen deze techniek minder gunstig voor studies naar de effecten van langdurige toename in eiwitexpressie maken. Dit zou bijzonder true voor eiwitten met korte halfwaardetijden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het voordeel van deze techniek boven andere is dat het produceert toename in eiwit en de activiteit in het longweefsel zelf. Bovendien dringt het meest distale gebieden van de long in plaats blijven net binnen de luchtwegen. We hebben een verhoogde eiwit-activiteit van onze injectaat zelfs na lavaging de luchtwegen met een zoutoplossing 15 gemeten. Tissue activiteit analyses geven aan dat het eiwit cellen binnendringen en niet alleen blijven in de luchtruimten van de muis. Dit werd verder bevestigd door immun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (7R01HL098528-03) en FAMRI's Klinische Innovator Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D’Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
