Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l'apoptose induite par l'alcool pendant la grossesse dans C57BL / 6
Summary
Les modèles expérimentaux proposés ici se concentrer sur l'étude des effets de l'exposition à l'alcool dans l'apoptose et l'application de peptide neurotrophique pendant la grossesse dans le cerveau du fœtus. Une description détaillée de l'élevage à la collecte de cerveau du fœtus est décrite. Techniques pour la détermination de l'apoptose sont également décrites en détail.
Abstract
Les modèles expérimentaux pour étudier les effets de l'exposition prénatale à l'alcool au cours de stades embryonnaires de la croissance du cerveau du fœtus sont difficiles. Cela est principalement dû à la difficulté de microdissection du cerveau du fœtus et leur sectionnement pour la détermination des cellules apoptotiques causées par l'exposition prénatale à l'alcool. Les expériences décrites ici fournir des techniques visualisées à partir des souris d'élevage à l'identification de la mort cellulaire dans les tissus du cerveau du fœtus. Cette étude a utilisé C57BL / 6 que le modèle animal pour l'étude de l'exposition d'alcoolisation fœtale et le rôle du peptide trophique contre l'apoptose induite par l'alcool. La sélection consiste en une fenêtre de matage en 2 heures pour déterminer le degré exact de l'âge embryonnaire. Un modèle d'exposition d'alcoolisation fœtale établie a été utilisée dans cette étude afin de déterminer les effets de l'exposition prénatale à l'alcool dans le cerveau du fœtus. Cela implique le libre accès à l'alcool ou nourri en régimes liquides comme la seule source de nutriments pour les souris enceintes.
<p class = "jove_content"> Les techniques impliquant dissection des fœtus et microdissection du cerveau du fœtus sont décrites avec soin, puisque celle-ci peut être difficile. Microdissection nécessite un microscope stéréoscopique et pince ultra-fines. Procédures étape par étape pour disséquer le cerveau du fœtus sont fournis visuellement. Les cerveaux sont disséqués foetales à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale.Pour enquêter sur l'apoptose, le cerveau du fœtus sont d'abord ancrées dans la gélatine à l'aide d'un moule pelable afin de faciliter leur sectionnement avec un appareil vibratome. Cerveau fœtal embarqués et fixes en paraformaldéhyde sont facilement sectionné, et les sections flottantes peuvent être montés en plus des diapositives SUPERFROST pour la détermination de l'apoptose ou mort cellulaire.
TUNEL (TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale) test a été utilisée pour identifier la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Il est à noter que l'APoptosis et la cytotoxicité à médiation cellulaire sont caractérisés par la fragmentation de l'ADN. Ainsi, les cellules TUNEL positifs visualisés sont révélateurs de la mort des cellules ou des cellules apoptotiques.
Les modèles expérimentaux ici fournissent des informations sur l'utilisation d'un régime liquide établi pour étudier les effets de l'alcool et le rôle des peptides neurotrophiques dans le cerveau pendant la grossesse foetus. Il s'agit de reproduction et d'alimentation des souris gravides, microdissecting cerveau du fœtus, et la détermination de l'apoptose. Ensemble, ces techniques visuelles et textuelles peuvent être une source d'enquêter sur l'exposition prénatale de substances nocives dans le cerveau du fœtus.
Introduction
L'objectif des méthodes expérimentales décrites ici est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de peptides trophiques dans un modèle d'exposition d'alcoolisation fœtale en utilisant plusieurs techniques concernant la reproduction, l'alimentation, microdissecting, et la détection de la mort cellulaire. Le travail de notre laboratoire a impliqué une diète liquide mélangé avec de l'alcool comme un modèle de consommation d'alcool modérée, ce qui pourrait être similaire à un paradigme à la consommation humaine en termes de la quantité d'alcool consommée 1-5. Nous et d'autres avons identifié trois peptides dérivés qui sont neuroprotecteur contre les effets délétères de l'exposition d'alcoolisme foetal. Les études portant sur l'exposition à l'alcool pendant les stades embryonnaires utilisant des modèles animaux peuvent conduire à l'identification des mécanismes potentiels de neuroprotection et de permettre le développement de procédures d'intervention. Cela peut fournir suffisamment d'informations sur les effets neuroprotecteurs et l'atténuation des effets délétères de l'exposition à l'alcool pendant la grossesse.
Prévention possible des effets de l'exposition prénatale à l'alcool peut impliquer le traitement des souris gravides avec des peptides qui ont été montrés pour être impliqués dans la neuroprotection in vitro et in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Parmi ces peptides, SALLRSIPA, connu sous le nom ADNF-9 ou SAL, est dérivé d'activité dépendant de facteur neurotrophique (ADNF) 7,10. Un autre peptide avec la séquence NAPVSIPQ peptide, appelé PAN, dérivé de la protéine neuroprotectrice dépendant de l'activité (ADNP) 6,11, a démontré un effet protecteur puissant contre le stress oxydatif associé à l'exposition à l'alcool 12,13. En outre, nous avons récemment identifié un nouveau peptide synthétisé, colivelin qui semble jouer un rôle clé neuroprotecteur dans le alcoolisation fœtale modèle d'exposition 2. Colivelin est composé de ADNF-9 et AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L'importance de l'utilisation de ces peptides, c'est qu'ils ont la capacité detraverser la barrière sang-cerveau pour prévenir les effets de l'apoptose induite par l'alcool et les déficits de croissance du cerveau.
Les méthodes expérimentales ont utilisé des souris C57BL / 6 pour tester les effets neuroprotecteurs contre l'apoptose induite par l'alcool. Nous avons adopté une fenêtre de 2 heures au lieu de reproduction pendant la nuit afin d'estimer avec précision le jour embryonnaire 0 (E0), car il peut être révélée par la détection d'un bouchon de sperme et un frottis vaginal 1-5. Nous avons utilisé une diète liquide avec des tubes d'alimentation, car cela est considéré comme libre accès au lieu de la livraison de l'alcool par voie gavage, ce qui peut induire un stress à des souris gravides. D'autre part, microdissection peut être difficile en raison de la douceur du tissu du cerveau du fœtus, ce qui peut être rencontrée en disséquant le cerveau du fœtus aux stades embryonnaires. Ici, nous montrons techniques visualisées pour faire face à tous les défis impliquant microdissection. En outre, depuis le sectionnement du cerveau du fœtus peut aussi être difficile, nous avons adoptéune technique qui consiste à intégrer le cerveau du fœtus en gélatine à l'aide pelable intégration des moules. Nous avons réussi à réduire le cerveau du fœtus dans les sections flottantes à 50 um d'épaisseur. Cela nous permet d'étudier des modifications de protéines contenu dans les sections du cerveau du fœtus, y compris l'identification de la mort cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthodologie et la technologie présentée dans cette étude mettent en évidence les effets de l'exposition prénatale à l'alcool dans le cerveau du fœtus et le rôle des peptides trophiques dans la prévention de ces effets. Ceux-ci peuvent fournir des informations sur la façon d'étudier d'autres drogues ou d'autres substances chimiques toxiques dans le cerveau du fœtus au cours des différentes étapes de la grossesse.
En ce qui concerne le paradigme de reprod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet de recherche a été soutenue par Nombre de prix R21AA017735 (YS) des Instituts national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme. Le contenu relève de la seule responsabilité de l'auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national sur l'abus d'alcool et l'alcoolisme ou de la National Institutes of Health. L'auteur tient également à remercier Charisse Montgomery pour éditer ce manuscrit.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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