Aislamiento y análisis de Brain-secuestrados Los leucocitos de<em> Plasmodium berghei</em> ANKA de ratones infectados

Summary

Un método para el aislamiento de los leucocitos inflamatorios adherentes de los vasos sanguíneos cerebrales de los<em> Plasmodium berghei</em> ANKA de ratones infectados se describe. El método permite la cuantificación así como la caracterización fenotípica de los leucocitos aislados después de la tinción con anticuerpos fluorescentes y el posterior análisis por citometría de flujo.

Abstract

Se describe un método para el aislamiento y caracterización de células adherentes inflamatorias de los vasos sanguíneos cerebrales de P. berghei ANKA-ratones infectados. La infección de las cepas susceptibles de ratón con esta cepa del parásito en los resultados de la inducción de la malaria cerebral experimental, un síndrome neurológico que recapitula algunos aspectos importantes de Plasmodium falciparum mediada por paludismo grave en ^1,2 seres humanos. Formas maduras de la malaria en etapa de sangre expresar proteínas parasitarias en la superficie de los eritrocitos infectados, lo que les permite unirse a las células endoteliales vasculares. Este proceso induce obstrucciones en el flujo sanguíneo, lo que resulta en hemorragias hipoxia y ³ y también estimula el reclutamiento de los leucocitos inflamatorios en el sitio de secuestro del parásito.

A diferencia de otras infecciones, es decir, virus neutrotopic ^4-6, ambas parasitados malaria-glóbulos rojos (pRBC) así como Inflamm asociadoAtory leucocitos permanecen secuestrados dentro de los vasos sanguíneos en lugar de infiltrar el parénquima cerebral. Así, para evitar la contaminación de los leucocitos secuestrados con no inflamatorias circulantes, células de perfusión intracardiaca extenso de los ratones infectados antes de la extracción de órganos y procesamiento de tejidos es necesario en este procedimiento para retirar el compartimento de la sangre. Después de la perfusión, los cerebros se cosechan y disecado en trozos pequeños. La estructura del tejido es más interrumpido por tratamiento enzimático con colagenasa D y DNAsa I. El homogeneizado cerebral resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll que permite la separación de secuestrados cerebro-leucocitos (BSL) de la mielina y los residuos de otro tejido. Las células aisladas se lavan a continuación, se contaron usando un hemocitómetro y se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para su posterior análisis por citometría de flujo.

Este procedimiento permite la caracterización fenotípica completa de la migración de los leucocitos inflamatorios en el cerebro en rerespuesta a varios estímulos, incluyendo accidente cerebrovascular, así como infecciones víricas o parasitarias. El método también proporciona una herramienta útil para la evaluación de nuevos tratamientos anti-inflamatorios en modelos animales preclínicos.

Protocol

1. La infección de ratones con P. berghei ANKA- Descongelar una alícuota de criopreservado P. berghei ANKA GRI. Reprime un cerebral malaria resistente a ratones BALB / c de ratón donante (8-12 semanas de edad) mediante la técnica de restricción de dos manos. Inyectar ratón con 100-200 l de pRBC utilizando una jeringa de 1 ml de insulina (28G aguja). Rutinariamente, 1-2 ratones donantes se inyectan. En 4-5 días post-infección (pi) eliminar ratón donante de la jaul…

Representative Results

Los resultados en la figura. 2 muestran porcentajes y números absolutos de las diferentes poblaciones BSL recuperados de los cerebros de los ratones control perfundidos o unperfused infectadas por la malaria e ingenuo. Aislado BSL fueron teñidas con PE-anti-NK1.1 y anticuerpos APC-anti-TCR-β como se indica en el texto del Protocolo. De acuerdo con resultados anteriores 7-9, αβTCR + células T comprende una elevada proporción de la piscina BSL en cerebros de perfundidos infectadas por la malar…

Discussion

El aislamiento y el análisis de BSL es un método que permite la caracterización y cuantificación de células inflamatorias que migran hacia el cerebro en respuesta a la lesión tisular o la infección en modelos experimentales de ratón. La introducción de un paso de perfusión intracardiaca para la retirada del compartimento de la sangre antes de la extracción de órganos y posterior aislamiento de las células es útil para prevenir la contaminación de células inflamatorias con no inflamatorias leucocitos circ…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Solutions and buffers
Giemsa’s azur eosin methylene blue solution	Merck Millipore	1.09204.0500	1:10 dilution in distilled water
RPMI medium			Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS			20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue	Sigma Aldrich	T-8154	1:2 dilution
Collagenase D	Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	From bovine pancreas
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% solution in PBS
Ultrapure Tris	Invitrogen	15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS	Gibco	1009
EDTA disodium salt	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
			Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803	R&D Systems	FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Equipment and material
SuperFrost microscope slide	Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors	REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir	Nalgene
Rubber tubing
23G needle	BD PrecisionGlide	302008
Cell dissociation kit containing metal sieve	Sigma Aldrich	CD-1
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
Hemocytometer	GmbH Neubauer	717810
Flow cytometry tubes	BD Falcon	352008