Isolering og analyse af Brain-sekvestrerede Leukocytter fra<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-inficerede mus
Summary
Fremgangsmåde til isolering af adhærente inflammatoriske leukocytter fra hjernen blodkar<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-inficerede mus er beskrevet. Fremgangsmåden tillader kvantificering og fænotypiske karakterisering af isolerede leukocytter efter farvning med fluorescerende antistoffer og efterfølgende analyse ved flowcytometri.
Abstract
Vi beskriver en fremgangsmåde til isolering og karakterisering af adhærente inflammatoriske celler fra hjernen blodkar P. berghei ANKA-inficerede mus. Infektion af modtagelige muse-stammer med denne parasit stamme resulterer i induktion af eksperimentel cerebral malaria, en neurologisk syndrom, der redegør for en række vigtige aspekter af Plasmodium falciparum-medieret alvorlig malaria hos mennesker 1,2. Modne former af blod-stage malaria udtrykker parasitiske proteiner på overfladen af den inficerede erythrocyt, som tillader dem at binde til vaskulære endotelceller. Denne proces inducerer forhindringer i blodstrømmen, hvilket resulterer i hypoxi og blødninger 3 og også stimulerer rekruttering af inflammatoriske leukocytter til stedet for parasitten binding.
I modsætning til andre infektioner, dvs neutrotopic vira 4-6, både malaria-parasitized røde blodlegemer (PRBC) samt tilhørende InflammBAGGRUNDEN leukocytter forbliver sekvestreres i blodkarrene i stedet for at infiltrere hjerneparenkymet. Således at undgå forurening af sekvestrerede leukocytter med ikke-inflammatoriske cirkulerende celler, omfattende intracardial perfusion af inficerede-mus forud for organdonation og væv behandling er påkrævet i denne procedure for at fjerne blod rum. Efter perfusion bliver hjerner høstet og dissekeret i små stykker. Vævsstrukturen yderligere afbrudt ved enzymatisk behandling med collagenase D og DNAse I. Det resulterende hjernehomogenat centrifugeres derefter på en Percoll-gradient, som tillader separation af hjerne-sekvestrerede leukocytter (BSL) fra myelin og andet væv debris. Isolerede celler vaskes derefter, talt under anvendelse af et hæmocytometer og farvet med fluorescerende antistoffer til efterfølgende analyse ved flowcytometri.
Denne procedure muliggør omfattende fænotypisk karakterisering af inflammatoriske leukocytter migrerer til hjernen i respons på forskellige stimuli, herunder slagtilfælde såvel som virale eller parasitiske infektioner. Fremgangsmåden tilvejebringer også et nyttigt værktøj til vurdering af nye antiinflammatoriske behandlinger i prækliniske dyremodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isoleringen og analyse af BSL er en fremgangsmåde, som muliggør karakterisering og kvantificering af inflammatoriske celler migrerer til hjernen som reaktion på vævsbeskadigelse eller infektion i eksperimentelle musemodeller. Indførelsen af en intracardial perfusion trin til fjernelse af blodfordelingsrummet før organ-ekstraktion og efterfølgende celleisolering er nyttig for at forhindre forurening af inflammatoriske celler med ikke-inflammatoriske cirkulerende leukocytter. Dette er måske ikke et væsentli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Miss Liana Mackiewicz til teknisk bistand. Dette arbejde blev gjort mulig gennem Victorian delstatsniveau operationelle infrastruktur Support og australske regering National Health og Medical Research Council IRIISS og Project Grant 1.031.212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
