Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten
Summary
Kv-Kanal Dysfunktion ist mit Herzrhythmusstörungen verbunden. Um zu untersuchen, die molekularen Mechanismen, die zu solchen Arrhythmien nutzen wir eine systematische Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit Knockout-Mäusen führen. Isolierte Herzmuskelzellen kann dann sofort für zellulare elektrophysiologische Studien, biochemischen oder Immunfluoreszenz (IF)-Assays verwendet werden.
Abstract
KCNE Gene für eine kleine Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten, die heteromeren Komplexe mit Kv-Kanal alpha-Untereinheiten bilden, um ihre funktionellen Eigenschaften zu modifizieren kodieren. Mutationen in KCNE Gene bei Patienten mit Herzrhythmusstörungen wie das Long-QT-Syndrom und / oder Vorhofflimmern gefunden. Allerdings bleibt die genaue molekulare Pathophysiologie, die zu diesen Krankheiten führt unklar. In früheren Studien die elektrophysiologischen Eigenschaften der Krankheit Mutationen in diesen Genen haben meist in heterologen Expressionssystemen untersucht worden und wir können nicht sicher sein, ob die berichteten Effekte können direkt in nativen Kardiomyozyten übersetzt werden. In unserem Labor setzen wir daher einen anderen Ansatz. Wir direkt zu untersuchen die Auswirkungen von KCNE Deletion in isolierten Herzmuskelzellen aus Knockout-Mäusen durch zelluläre Elektrophysiologie – eine einzigartige Technik, die wir beschreiben, in dieser Ausgabe des Journal of Visualized Experiments. Die Herzen von genetically entwickelt KCNE Mäusen schnell ausgeschnitten und montiert auf einem Langendorff-Apparatur durch Aorten Kanülierung. Freiem Ca 2 + in dem Myokard durch EGTA gebunden und Dissoziation von Herzmuskelzellen wird dann durch retrograde Perfusion der Koronararterien mit einem spezialisierten niedrigen Ca 2 +-Puffer, der Kollagenase erreicht. Atria, freien rechtsventrikulären Wand und die linke Herzkammer kann dann durch mikrochirurgische Techniken getrennt werden. Calcium wird dann langsam wieder auf isolierte Herzmuskelzellen in einem mehrstufigen Waschvorgangs zugegeben umfassend. Atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten gesundes Aussehen ohne spontane Kontraktionen werden dann sofort an elektrophysiologische Untersuchungen durch Patch-Clamp-Technik oder andere biochemische Analysen innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Isolierung unterzogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der wachsenden Entwicklung von gentechnisch veränderten Mauslinien die Herzfunktion und kardiale Pathologie zu Gen-Deletion zu studieren gibt es auch ein zunehmendes Interesse an spezialisierte Methoden, um Effekte der speziellen Gen-Deletion in vitro zu untersuchen. In unserem Labor untersuchen wir die Rolle einer Familie von Kv-Kanal zusätzlichen Untereinheiten auf die kardiale Repolarisation. Die KCNE Gene umfassen eine Familie von 5 Gene (KCNE1-5), die eine wichtige Rolle in der mens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung und der Charité / MDC finanziert.
Materials
| Name of the Reagent | Company |
| Tetrodotoxin | Alomone |
| 4-aminopyridine | ICN Biomedicals |
| Heteropodatoxin 2 | Alomone |
| Tetraethylammonium | Sigma Chemicals |
| Collagenase Type 2 | Worthington |
References
- Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?. Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
- Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
- Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?. Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
- Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D’Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
- Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
- Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
- Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
- Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
- Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
- McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
- Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
- Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
- Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
- Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
- Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
- Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
- Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
- Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
- Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
- Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).
