Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em> Drosophila</em> Embryogenese
Summary
Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel klaring<em> In vivo</em>. Deze methode maakt gebruik van wonen<em> Drosophila</em> Embryo als een krachtig model voor de monitoring fagocytose van apoptotische cellen met behulp van specifieke kenmerken van apoptotische cellen en fagocyten.
Abstract
De correcte verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose (apoptotische cel klaring) is cruciaal voor de normale ontwikkeling in alle metazoan organismen. Apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces nauw verbonden celdood; unengulfed apoptotische cellen worden nauwelijks waargenomen in vivo onder normale omstandigheden. Om de verschillende stappen van apoptotische cellen klaring begrijpen en 'professionele' fagocyten vergelijken – macrofagen en dendritische cellen "niet-professionele" – tissue-resident naburige cellen, in vivo beeldvorming van levende het proces is zeer waardevol. Hier een protocol voor het bestuderen van apoptotische cel klaring in levende Drosophila embryo's beschrijven we. De dynamiek van verschillende stappen in fagocytose we specifieke merkers voor apoptotische cellen en fagocyten volgen. Daarnaast kunnen wij monitoren twee fagocytensysteem systemen parallel: 'professionele' macrofagen en 'semi-professional 'glia in de ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CNS). De hier beschreven methode maakt gebruik van het Drosophila embryo als een uitstekend model voor real time studie van apoptotische cel klaring.
Introduction
De goede verwijdering van ongewenste of afwijkende cellen door apoptose en daaropvolgende fagocytose is essentieel voor de embryonale ontwikkeling en voor weefsel homeostase in de volwassene. Fagocytose van apoptotische cellen of apoptotische cel klaring is een zeer dynamisch proces dat verloopt in vier stappen: (1) werving van fagocyten aan de apoptotische cel ('vind-me'), (2) de erkenning van de cel als doelwit voor fagocytose ( 'eet-me') en (3) engulfment, gevolgd door (4) phagosome rijping en afbraak van de apoptotische deeltje 1-5. Er zijn twee soorten fagocyten: 'professionele' macrofagen en onvolgroeide dendritische cellen, en de 'niet-professionele' tissue-resident naburige cellen, die cruciaal zijn voor apoptotische cel klaring tijdens metazoan ontwikkeling 6,7 zijn.
In Drosophila ontwikkeling, de eliminatie van overbodige cellen door apoptose optreedt in drie main fasen, eerst in het midden tot eind embryo, dan in het midden van de pop, en opnieuw in de vroege volwassenheid. Tijdens de embryogenese apoptotische deeltjes worden verwijderd door 'professionele' fagocyten, macrofagen, en door de 'niet-professionele' ectoderm en glia 8,9.
In ons voorgaande werk hebben we een fagocytische receptor, Six-micron-kader (SIMU), die uitsluitend wordt uitgedrukt in fagocytische cellen gedurende embryogenese geïdentificeerd. Met behulp van de simulatie promotor we gegenereerd een specifieke marker voor fagocyterende celpopulaties (simulatie-cytGFP), die ons in staat stelt gelijktijdig te volgen macrofagen, ectoderm en glia in een live ontwikkelende embryo 8. Bovendien, door specifieke merkers voor apoptotische cellen in verschillende stadia van apoptose, kunnen wij de dynamiek van gladde spiercellen in vivo klaring te volgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apoptotische cel klaring is een kritieke laatste fase van apoptose, die zeer dynamisch. Daarom real time studie van het proces van het grootste belang. Hier een protocol dat het toezicht van apoptotische cel klaring maakt in levende ontwikkelen Drosophila embryo's beschrijven we. In deze procedure moet twee populaties van cellen gekleurd met specifieke merkers: apoptotische cellen en fagocyten. Het simuleren cytGFP reporter is geschikt voor het bewaken fagocytische macrofagen, glia en ectoderm geli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Marie Curie Reïntegratie Grant (IRG249084). Wij danken alle leden van de Kurant laboratorium.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
