Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em> Drosophila</em> Эмбриогенеза
Summary
Здесь мы опишем эффективным методом исследования динамики апоптоза клетки оформление<em> В естественных условиях</em>. Этот метод использует жить<em> Drosophila</em> Эмбрионов в качестве мощного модель для мониторинга фагоцитоз апоптотических клеток с использованием специфических маркировки апоптотических клеток и фагоцитов.
Abstract
Надлежащего устранения нежелательных или аберрантных клеток путем апоптоза и последующего фагоцитоза (апоптоза оформления ячейки) имеет решающее значение для нормального развития во всех многоклеточных организмов. Апоптотическая оформления ячейки весьма динамичный процесс тесно связан с гибелью клеток; unengulfed апоптоза клеток почти не видели в естественных условиях при нормальных условиях. Для того чтобы понять различные этапы оформления апоптоза клеток и сравнить "профессионального" фагоциты – макрофаги и дендритные клетки на "непрофессиональной" – ткани-резидент соседние клетки, в естественных условиях живого изображения процесса является чрезвычайно ценным. Здесь мы опишем протокол для изучения апоптоза оформления ячейки в живых эмбрионов дрозофилы. Чтобы проследить динамику различных этапов фагоцитоза мы используем для специфических маркеров апоптоза клеток и фагоцитов. Кроме того, мы можем контролировать два фагоцитов систем параллельно: "профессиональных" макрофагах и "полу-Professional 'глии в развитие центральной нервной системы (ЦНС). Метод, описанный здесь использует эмбриона дрозофилы как отличную модель для исследования реальных время апоптоза оформление клетки.
Introduction
Надлежащего устранения нежелательных или аберрантных клеток путем апоптоза и последующего фагоцитоза имеет решающее значение для эмбрионального развития, а также для тканевого гомеостаза у взрослых. Фагоцитоз апоптоза клеток или апоптоз оформления ячейки весьма динамичный процесс, который продолжается в четыре этапа: (1) набор фагоцитов апоптоза клетки ("находят меня '), (2) признания ячейки в качестве мишени для фагоцитоза ( 'есть-меня') и (3) охвате, а затем (4) фагосома созревания и деградации апоптоза частиц 1-5. Есть два типа фагоцитов: «профессиональный» макрофагов и незрелых дендритных клеток, и "непрофессиональной" ткани-резидент соседних клеток, которые имеют решающее значение для оформления апоптоза клеток во время развития многоклеточных 6,7.
В развитии дрозофилы, устранение лишних клеток путем апоптоза происходит в три мАйн этапа, первый в середине-конце эмбриона, а затем в середине куколки, а затем в начале взрослой. Во время эмбриогенеза апоптоз частицы удаляются "профессионального" фагоциты, макрофаги, а к "непрофессиональной" эктодермы и глии 8,9.
В нашей предыдущей работе мы определили фагоцитарного рецептора, шести-микрон-под (SIMU), которая выражается исключительно в фагоцитирующих клеток во время эмбриогенеза. Использование промоутер сима мы получили специфический маркер фагоцитарной клеточных популяций (симу-cytGFP), который позволяет нам отслеживать макрофаги, эктодермы и глии одновременно в живом развивающемся эмбрионе 8. Кроме того, с помощью специальных маркеров апоптоза клеток на разных стадиях апоптоза, мы можем проследить динамику апоптоза оформление клетки в живом организме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Апоптоза зазор клетка является критическим последней стадии апоптоза, который равен высокой динамичностью. Поэтому реальные исследования времени процесса имеют первостепенное значение. Здесь мы опишем протокол, который позволяет контролировать оформление апоптоза клетки в живых р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Марии Кюри реинтеграции Грант (IRG249084). Мы благодарим всех членов Kurant лаборатории.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
References
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
