Identification des<em> Belle au Bois Dormant</em> Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l'éditeur de liens médiée par PCR

Summary

Procédé d'identification de la cancérogenèse conducteurs inconnus en utilisant une approche impartiale est décrit. La méthode utilise l'<em> Belle au Bois Dormant</em> Transposon comme un agent mutagène aléatoire dirigé vers des tissus spécifiques. Cartographie génomique des insertions de transposons qui sous-tendent la formation de tumeurs identifie nouveaux oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs

Abstract

Génomiques, les analyses protéomiques, transcriptomiques, et épigénomiques de tumeurs humaines indiquent qu'il ya des milliers d'anomalies au sein de chaque génome du cancer par rapport aux tissus normaux appariés. Sur la base de ces analyses, il est évident qu'il ya beaucoup d'inconnues pilotes génétiques du cancer ^1. Malheureusement, ces pilotes sont cachés dans un plus grand nombre d'anomalies particulières dans le génome qui ne contribuent pas directement à la formation de tumeurs. Un autre aspect du génome du cancer, c'est qu'il ya grande hétérogénéité génétique au sein des mêmes types de tumeurs. Chaque tumeur peut héberger des mutations différentes qui offrent un avantage sélectif pour la formation de tumeurs ^2. Exécution d'une impartiale écran vers l'avant génétique chez la souris fournit les outils pour générer des tumeurs et d'analyser leur composition génétique, tout en réduisant le contexte de mutations particulières. La Belle au bois dormant (SB) transposon système est une de ces méthodes ^3. Le système utilise SB portable vecteurs (transposons) qui peuvent être insérés dans le génome par l'enzyme transposase. Mutations sont limités à un type de cellule spécifique grâce à l'utilisation d'un allèle conditionnel transposase qui est activé par la recombinase Cre. Il existe de nombreuses lignées de souris qui expriment la recombinase Cre dans des tissus spécifiques. En croisant l'une de ces lignes à l'allèle transposase conditionnelle (par exemple Lox-stop-Lox-SB11), le système ASR est activé uniquement dans les cellules qui expriment la recombinase Cre. La recombinase Cre sera une cassette d'accise arrêt qui bloque l'expression de l'allèle transposase, activant ainsi mutagenèse par transposon dans le type de cellule désignée. Un écran SB est initiée par l'élevage de trois souches de souris transgéniques afin que les souris expérimentales porteurs d'un allèle conditionnel transposase, un concatémère de transposons, et un allèle spécifique du tissu recombinase Cre. Ces souris sont autorisés à l'âge jusqu'à la formation de tumeurs et ils deviennent moribonds. Les souris sont ensuiteADN autopsiés et génomique est isolé à partir des tumeurs. Ensuite, l'ADN génomique est soumis à une liaison médiée par PCR (LM-PCR) qui entraîne une amplification du locus génomiques contenant un transposon SB. LM-PCR réalisée sur une seule tumeur se traduira par des centaines de amplicons distincts représentant les centaines de loci génomiques contenant insertions de transposons dans un ⁴ seule tumeur. Les insertions de transposons dans toutes les tumeurs sont analysées et sites d'insertion communs (Ciss) sont identifiés à l'aide d'une méthode statistique appropriée ^5. Gènes au sein de la CEI sont très susceptibles d'être des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs, et sont considérés comme les gènes du cancer candidats. Les avantages de l'utilisation du système SB pour identifier les gènes responsables du cancer candidats sont les suivants: 1) le transposon peut être facilement localisé dans le génome parce que sa séquence est connue, 2) la transposition peuvent être adressées à presque n'importe quel type de cellule et 3) le transposon est capable de introduire à la fois le gain et la ^{perte-de-fonction-6} mutations. Le following protocole décrit comment concevoir et d'exécuter un écran vers l'avant génétique à l'aide du système SB transposon pour identifier les gènes responsables du cancer candidats (Figure 1).

Protocol

1. L'élevage et le vieillissement des animaux transgéniques Sélectionnez les souches de souris transgéniques appropriés pour votre expérience. Une expérience typique utilisera trois lignées transgéniques; une souris transposase conditionnelle, une souris hébergeant un concatémère de transposons, et une souris exprimant la recombinase Cre dans les cellules considérées comme les cellules d'origine pour le cancer désiré. Si le cancer est modélisé a une mutation connue dans un g…

Representative Results

Après le schéma de sélection a été mis en place, les éleveurs doivent produire une portée tous les 19-21 jours. La taille des portées varie entre 5 et 12 chiots, en fonction de l'âge des éleveurs et l'arrière-plan génétique. En outre, assurez-vous que le génotype de la litière suit la génétique mendélienne comme un moyen de confirmer que le schéma de sélection est à la fois correcte et réussie. Pour que l'expérience soit un succès, l'incidence des tume…

Discussion

Un écran vers l'avant génétique à l'aide de la Belle au Bois Dormant système transposon fournit une méthode pour identifier les mutations qui causent le cancer. En sélectionnant le promoteur adéquat pour contrôler la recombinase Cre en plus des mutations prédisposant, l'écran SB permettra d'identifier de nouveaux gènes connus et candidats cancer.

Le succès d'un écran SB est largement tributaire des souris sélectionnées pour créer l'?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Sure-Seal Induction Chamber	Brain Tree Scientific	EZ-177
Cryovial	Bioexpress	C-3355-2
10% Buffered Formalin	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Protein Precipitation solution	Qiagen	158910
Cell lysis buffer	Qiagen	158906
Proteinase K	Qiagen	158920
RNase A	Qiagen	158924
TE Buffer	Promega	V6232
BfaI	New England Biolabs	R0568S
NlaIII	New England Biolabs	R0125S
MinElute 96 well plates	Qiagen	28051
QIAvac 96 Vacuum manifold	Qiagen	19504
Multi-MicroPlate Genie, 120V	Scientific Industries, Inc.	SI-4000
T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer	Invitrogen	15224-041
BamHI	New England Biolabs	R0136S
25mM dNTPs	Bioexpress	C-5014-200
Platinum Taq	Invitrogen	10966-034
FastStart Taq DNA Polymerase	Roche	12032929001
Agarose	Promega	V3121
TAE Buffer	Promega	V4271
TE Buffer	Promega	V6232
Ethidium bromide	Promega	H5041