تحديد<em> الجمال النائم</em> الإدراج ينقول في الأورام الصلبة باستخدام رابط بوساطة PCR
Summary
ووصف طريقة التعرف السائقين غير معروف من التسرطن باستخدام نهج غير متحيز. أسلوب يستخدم<em> الجمال النائم</em> ينقول بوصفها المغير العشوائية الموجهة إلى أنسجة معينة. رسم الخرائط الجينية من الإدراج ينقول التي تدفع تشكيل الورم يحدد الجينات المسرطنة الرواية والجينات الكابتة للورم
Abstract
الجينومية وتحليل البروتين، transcriptomic، وepigenomic الأورام الإنسان تشير إلى أن هناك الآلاف من الحالات الشاذة في كل جينوم السرطان مقارنة مطابقة الأنسجة الطبيعية. بناء على هذه التحليلات من الواضح أن هناك العديد من السائقين الجينية غير مكتشفة من السرطان 1. للأسف مخفية ضمن برامج التشغيل هذه عدد أكبر بكثير من الحالات الشاذة الركاب في الخريطة الوراثية البشرية التي لا تساهم مباشرة في تشكيل الورم. وثمة جانب آخر للجينوم السرطان أن هناك عدم تجانس كبير الوراثية ضمن أنواع الأورام مماثلة. يمكن لكل ورم تؤوي الطفرات المختلفة التي توفر ميزة انتقائية لتكوين ورم 2. أداء غير منحازة شاشة الوراثية إلى الأمام في الفئران يوفر الأدوات اللازمة لتوليد أورام وتحليل تركيبتها الجينية، مع الحد من خلفية الطفرات الركاب. ونظام النوم الجمال ينقول (SB) هو أسلوب واحد من هذا القبيل 3. النظام يستخدم المحمول SB الخامسectors (ترانسبوزونات) التي يمكن إدراجها في جميع أنحاء الجينوم من قبل انزيم transposase. وتقتصر الطفرات إلى نوع خلية معينة من خلال استخدام أليل transposase الشرطي الذي يتم تفعيلها من خلال لجنة المساواة العرقية Recombinase. خطوط الماوس وجود العديد من لجنة المساواة العرقية التي Recombinase صريحة في أنسجة معينة. عن طريق عبور واحدة من هذه الخطوط إلى أليل transposase المشروطة (مثل السلمون المدخن للتوقف وكس-SB11)، يتم تنشيط نظام SB فقط في الخلايا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية Recombinase. ستقوم لجنة المساواة العرقية Recombinase المكوس شريط التوقف الذي يمنع التعبير عن أليل transposase، وبالتالي تفعيل الطفرات ينقول في نوع من الخلايا المعينة. يبدأ على شاشة SB عن طريق تربية ثلاث سلالات من الفئران المعدلة وراثيا بحيث تحمل الفئران التجريبية أليل transposase المشروط، وهو concatamer من ترانسبوزونات، وRecombinase لجنة المساواة العرقية أليل الأنسجة محددة. ويسمح لهذه الفئران في العمر حتى شكل أورام وتصبح المحتضرة. الفئران هي ثميتم عزل الحمض النووي الجيني وnecropsied من الأورام. المقبل، وتعرض الحمض النووي الجيني لPCR-رابط بوساطة (LM-PCR) التي تؤدي إلى التضخيم من مواضع الجينومية التي تحتوي على ينقول SB. LM-PCR يقوم على وجود ورم واحد سيؤدي إلى مئات amplicons متميزة تمثل مئات مواضع الجينومية التي تحتوي على الإدراج في 4 ينقول ورم واحد. يتم تحليل الإدراج ينقول في جميع الأورام وتحديد المواقع الإدراج المشترك (كيبك) باستخدام الأساليب الإحصائية المناسبة 5. الجينات داخل رابطة الدول المستقلة من المرجح للغاية أن تكون الجينات المسرطنة أو الجينات الكابتة للورم، وتعتبر جينات السرطان مرشح. مزايا استخدام نظام لتحديد الجينات SB سرطان المرشحة هي: 1) يمكن بسهولة أن يكون موجودا ينقول في الجينوم لأنه من المعروف تسلسل لها، 2) تبديل يمكن أن يوجه إلى نوع تقريبا أي خلية و3) وقادر على ينقول عرض كل مكسب والخسارة من وظيفة الطفرات 6. وfollowiنانوغرام بروتوكول يصف كيفية وضع وتنفيذ شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام ينقول SB لتحديد جينات السرطان مرشح (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
شاشة الوراثية إلى الأمام باستخدام نظام النوم ينقول الجمال يوفر طريقة لتحديد الطفرات التي تسبب السرطان. عن طريق اختيار المروج المناسبة لمراقبة لجنة المساواة العرقية Recombinase بالإضافة إلى أي طفرات المهيئة، فإن الشاشة SB تحديد جينات جديدة معروفة وسرطان مر?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر براندن Moriarity، Largaespada ديفيد، وكنج فنسنت في جامعة مينيسوتا، ودوبوي آدم في جامعة ولاية ايوا لمساعدتهم في تطوير بروتوكول الموصوفة أعلاه.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
