Identificazione dei<em> Bella Addormentata</em> Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR
Summary
Un metodo di identificazione conducenti sconosciuti di carcinogenesi utilizzando un approccio imparziale è descritto. Il metodo utilizza l'<em> Bella Addormentata</em> Trasposone come mutageno casuale diretto a tessuti specifici. Mappatura genomica di inserzioni di trasposoni che guidano la formazione del tumore identifica nuovi oncogeni e geni oncosoppressori
Abstract
Genomiche, analisi proteomica, trascrittomica e epigenomic di tumori umani indicano che ci sono migliaia di anomalie all'interno di ogni genoma del cancro rispetto al corrispondente tessuto normale. Sulla base di queste analisi è evidente che ci sono molti piloti sconosciute genetiche del cancro 1. Purtroppo questi driver sono nascoste all'interno di un numero molto maggiore di passeggeri anomalie nel genoma che non contribuiscono direttamente alla formazione del tumore. Un altro aspetto del genoma del cancro è che vi è una notevole eterogeneità genetica all'interno simili tipi di tumore. Ogni tumore può ospitare differenti mutazioni che forniscono un vantaggio selettivo per la formazione del tumore 2. Esecuzione di un imparziale schermo in avanti genetica nei topi fornisce gli strumenti per generare tumori e analizzare la loro composizione genetica, riducendo lo sfondo di mutazioni passeggeri. La bella addormentata (SB) trasposoni sistema è uno di questi metodi 3. Il sistema utilizza Mobile V SBettori (trasposoni) che possono essere inseriti nel genoma dall'enzima trasposasi. Mutazioni sono limitati a un tipo specifico di cellula attraverso l'uso di un allele trasposasi condizionale che viene attivato da ricombinasi Cre. Esistono molte linee di topi che esprimono ricombinasi Cre in tessuti specifici. Attraversando una di queste linee per l'allele trasposasi condizionale (ad es Lox-stop-Lox-SB11), il sistema SB si attiva solo nelle cellule che esprimono Cre ricombinasi. La ricombinasi Cre sarà accise una cassetta di arresto che blocca l'espressione dell'allele trasposasi, attivando così mutagenesi trasposone nel tipo di cellula designato. Uno schermo SB è avviata da allevando tre ceppi di topi transgenici in modo che i topi sperimentali portano un allele condizionale trasposasi, un concatamer dei trasposoni, e un tessuto-specifico allele ricombinasi Cre. Questi topi sono lasciati maturare fino a formare tumori e diventano moribondo. I topi sono poiDNA genomico necroscopia ed è isolato dai tumori. Successivamente, il DNA genomico è sottoposto a linker-mediata-PCR (LM-PCR) che si traduce in amplificazione di loci genomici contenenti un trasposone SB. LM-PCR eseguita su un singolo tumore provocherà centinaia di ampliconi distinti rappresentano le centinaia di loci genomici contenenti inserzioni di trasposoni in un 4 singolo tumore. Le inserzioni di trasposoni in tutti i tumori vengono analizzati e siti di inserzione comuni (Ciss) sono identificati con un adeguato metodo statistico 5. I geni all'interno del CIS sono altamente probabile che sia oncogeni o geni oncosoppressori, e sono considerati i geni del cancro candidati. I vantaggi di usare il sistema SB per identificare geni tumorali candidati sono: 1) il trasposone può essere facilmente collocato nel genoma perché la sua sequenza è nota, 2) trasposizione può essere diretto a qualsiasi tipo di cellula e 3) il trasposone è in grado di sia l'introduzione di guadagno e perdita-di-funzione mutazioni 6. Il following protocollo descrive il modo di concepire ed eseguire una schermata in avanti genetica utilizzando il sistema SB trasposoni per identificare i geni del cancro candidati (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Viene visualizzata una schermata in avanti genetica utilizzando il sistema di Sleeping Beauty trasposone fornisce un metodo per identificare le mutazioni che causano il cancro. Selezionando il promotore appropriato controllare ricombinasi Cre in aggiunta a qualsiasi mutazioni predisponenti, lo schermo SB identificherà noti e nuovi geni del cancro candidati.
Il successo di uno schermo SB dipende in larga misura i topi selezionati per creare lo schermo. Per il trasposone, si…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Moriarity Branden, David Largaespada, e Vincent Keng presso l'Università del Minnesota, e Adam Dupuy presso la University of Iowa per la loro assistenza nello sviluppo del protocollo sopra descritto.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
References
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