Optogenetic Aktivering af zebrafisk somatosensoriske Neuroner med Chef-tdTomato
Summary
Optogenetic teknikker har gjort det muligt at studere bidrag fra bestemte neuroner til adfærd. Vi beskriver en metode i larvernes zebrafisk til aktivering enkelt somatosensoriske neuroner udtrykker et channelrhodopsin variant (kok) med en diode-pumpet solid state (DPSS) laser og registrere fremkaldte adfærd med en high-speed video kamera.
Abstract
Larvestadium zebrafisk dukker op som en model til at beskrive udviklingen og funktionen af simple neurale kredsløb. På grund af deres eksterne befrugtning, hurtige udvikling, og gennemskinnelighed, er zebrafisk særlig velegnet til optogenetic fremgangsmåder til at undersøge neural kredsløbsfunktion. I denne fremgangsmåde er lysfølsomme ionkanaler udtrykkes i specifikke neuroner, således eksperimentatoren for at aktivere eller inhibere dem efter behag og derved vurdere deres bidrag til specifikke adfærd. Anvendelse af disse metoder i larvernes zebrafisk er begrebsmæssigt enkel, men kræver optimering af tekniske detaljer. Her har vi demonstrere en procedure til at udtrykke et channelrhodopsin variant i larvernes zebrafisk somatosensoriske neuroner, foto-aktiverende enkelte celler, og registrere deraf adfærd. Ved at indføre et par ændringer til tidligere etablerede metoder, kan denne fremgangsmåde anvendes til at fremkalde adfærdsmæssige reaktioner fra enkelte neuroner aktiverede optil mindst 4 dage efter befrugtning (DPF). Konkret har vi skabt et transgen ved hjælp af en somatosensoriske neuron enhancer, CREST3, at drive ekspressionen af den mærkede channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato. Injektion af dette transgen i 1-celle embryoer resulterer i mosaik ekspression i somatosensoriske neuroner, der kan afbildes med konfokal mikroskopi. Illuminating identificerede celler i disse dyr med lys fra en 473 nm DPSS laser, guidet gennem et fiberoptisk kabel, fremkalder adfærd, der kan optages med en high-speed video kamera og analyseret kvantitativt. Denne teknik kan tilpasses til at studere adfærd fremkaldt ved at aktivere nogen zebrafisk neuron. Ved at kombinere denne tilgang med genetiske eller farmakologiske forstyrrelser vil være en effektiv måde til at undersøge kredsløb dannelse og funktion.
Introduction
Udviklingen af optogenetic fremgangsmåder til at fremme eller inhibering af neuronal excitabilitet med definerede bølgelængder af lys har gjort det muligt at studere funktionen af forskellige populationer af neuroner i neurale kredsløb der styrer adfærd 1, 19, 21. Denne teknik anvendes ofte til at aktivere grupper af neuroner, men det kan også anvendes til aktivering af individuelle neuroner. Zebrafisk larver er særligt modtagelige for disse metoder, da de er gennemsigtige, deres nervesystem udvikler sig hurtigt, og skabe transgene dyr er hurtig og rutine. Dog skal betydelige tekniske forhindringer overvindes til pålideligt at opnå en enkelt neuron aktivering.
For at optimere en procedure for optogenetic aktivering af enkelte zebrafisk neuroner, vi fokuserede på somatosensoriske neuroner. Zebrafisk larver opdage en bred vifte af somatosensoriske stimuli ved hjælp af to populationer af neuroner: trigeminale neuroner, der innerverer hoved og Rohon-skæg (RB) neuroner, som innerverer resten af kroppen. Hver trigeminal og RB neuron forventer en perifer Axon, at filialer i udstrakt grad i huden til at opdage stimuli og en central axon, der forbinder til downstream neurale kredsløb. Dyr reagerer at røre så tidligt som 21 timer efter befrugtning (HPF), hvilket indikerer, at en sammenhængende somatosensoriske kredsløb har dannet 5, 18. Under larveudvikling mindste nogle trigeminal og RB neuroner synapse på Mauthner cellen for at aktivere klassiske escape reaktioner, men akkumulerende beviser tyder på, at der er flere klasser af somatosensoriske neuroner med forskellige mønstre til tilslutning, der kan fremkalde variationer på escape adfærd 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vores motivation for at udvikle denne metode var at karakterisere den adfærdsmæssige funktion af forskellige klasser af somatosensoriske neuroner, men denne fremgangsmåde kunne i princippet anvendes til at studere funktionen af næsten enhver neuron eller population af neuroner i larval zebrafisk.
Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåde til aktivering Channelrhodopsin-2-udtrykkende somatosensoriske neuroner med blåt lys, fremkalde escape adfærd 3. Deres tilgang anvendes en enhancer element fra isl1 genet at drive ekspression af CHR2-EYFP i somatosensoriske neuroner. Dette transgen blev imidlertid rapporteret at vise relativt svag fluorescens, der kræver co-injektion af en anden reporter, at UAS :: GFP, tillade visualisering af celler, der udtrykker CHR2-EYFP. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at fremkalde adfærd reaktioner mellem 24-48 HPF, men aldrig kunne fremkalde en reaktion forbi 72 HPF. Mens denne metode virker for at studere neurale kredsløb i meget tidlige larvestadier (24-48 HPF), det er utilstrækkeligt til at karakterisere neurale kredsløb og adfærdsmæssige reaktioner hos ældre larver, når flere forskellige adfærdsmæssige reaktioner er synlige og neurale kredsløb er mere modne.
Vi forsøgte atforbedre følsomheden af denne teknik for at karakterisere funktionen af subpopulationer af larve-RB neuroner. At forbedre ekspression brugte vi en somatosensoriske-specifik enhancer (CREST3) 20 at drive ekspression af LexA-VP16 og en strækning af LexA-operator-sekvenser (4xLexAop) 11 til at amplificere ekspressionen af en fluorescerende mærket lysaktiveret kanal. Denne konfiguration amplificeret ekspression af kanalen, hvilket eliminerer behovet for co-ekspression af en anden reporter, og tillader os at direkte bestemme den relative forekomst af kanalen i hver neuron. Ved hjælp af LexA / LexAop-sekvensen havde den yderligere fordel at tillade os at indføre transgenet i zebrafisk reporter linjer, der bruger Gal4/UAS system. Forbigående ekspression af dette transgen resulterede i varierende niveauer af ekspression, men var sædvanligvis tilstrækkelig robust til at visualisere både cellelegemet og axonale projektioner af individuelle neuroner over flere dage. For at optimere følsomtet at tænde vi brugte lyset aktiverede kanal Chef, en channelrhodopsin variant, der består af en kimære af channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover websted på helix loop EF 13. Denne kanal er aktiveret ved den samme bølgelængde som CHR2, men kræver lavere lysintensitet for aktivering, hvilket gør det mere følsomme end andre almindeligt anvendte kanaler, herunder CHR2. Kokken protein blev fusioneret til rødt fluorescerende protein, tdTomato, så vi kan screene for proteinekspression uden at aktivere kanalen. Som lyskilde, anvendte vi en diode pumpet solid-state (DPSS) laser koblet til et fiberoptisk kabel til at levere en præcis, kraftig impuls af blåt lys i en specifik region af larverne. Dette tillod os at fokusere laserlys på individuelle neuroner, hvilket eliminerer behovet for at finde sjældne transgene dyr, der udtrykker kanalen på en enkelt neuron. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at aktivere en enkelt RB neuroner, optage adfærdsmæssig reaktions med en high-speed video kamera, og billedet de aktiverede neuroner i høj opløsning med konfokal mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en metode til optogenetic aktivering af enkelte RB neuroner i levende zebrafisk. Vores metode anvender forbigående transgenese at udtrykke en fluorescens mærket channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato 13, i særlige somatosensoriske neuroner. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til anvendelse i andre larve zebrafisk cellepopulationer.
Brug af denne tilgang, vi konsekvent fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner fra 34 til 48 HPF larver udtrykker Chef-tdTomato. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fumi Kubo, Tod Thiele og HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) for rådgivning om adfærd eksperimenter og DPSS laser iværksat; Heesoo Kim og Chiara Cerri fra MBL Neurobiologi Kursus for at bistå i Chef-tdTomato eksperimenter, PetronellaKettunen (Göteborgs Universitet ) for første samarbejde om optogenetic eksperimenter, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca og John Milligan (UCLA) for teknisk rådgivning og Roger Tsien (UCSD) til Chef-tdTomato konstruere. Dette arbejde blev støttet af en NRSA (5F31NS064817) tildeling til AMSP og en bevilling fra NSF (RIG: 0.819.010) til AS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
