Neonatal Subventricular Zone Elektroporation
Summary
Vi viser en minimalt invasiv teknik kaldet neonatal subventricular zone elektroporering. Teknikken består i at injicere plasmid-DNA i de laterale ventrikler af neonatale hvalpe og anvendelse af elektrisk strøm til at levere og genmanipulere neurale stamceller
Abstract
Neurale stamceller (NSC) line den postnatale laterale ventrikler og giver anledning til flere celletyper, der indbefatter neuroner, astrocytter, og ependymal celler 1.. Forståelse af de molekylære veje, der er ansvarlige for NSC selvfornyelse, engagement og differentiering er kritisk for at udnytte deres unikke potentiale til at reparere hjernen og bedre forstå sygdomme i centralnervesystemet. Tidligere metoder til manipulering af mammale systemer krævede tidskrævende og dyrt, for genteknologien på hele dyret niveau 2. Således har hovedparten af undersøgelser undersøgt funktioner NSC-molekyler in vitro eller in hvirvelløse dyr.
Her vil vi demonstrere den enkle og hurtige teknik til at manipulere neonatale NPCs der omtales som neonatal subventricular zone (SVZ) elektroporation. Lignende teknikker blev udviklet et årti siden for at studere embryonale NSC og har hjulpet undersøgelser af cortical udvikling 3,4. For nylig dette blev anvendt til at studere den postnatale gnaver forhjerne 5-7. Denne teknik resulterer i robust mærkning af SVZ NSC og deres afkom. Således postnatal SVZ elektroporering giver en omkostningseffektiv og tid effektivt alternativ til pattedyr NSC genteknologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi detaljeret teknikken med neonatal SVZ elektroporering, en teknik til hurtigt og robust mærke og manipulere SVZ stamceller og deres afkom. Der er flere fordele, at elektroporering har i sammenligning med andre teknikker. For det første på grund af den fokale mærkning af celler, er man i stand til at skelne celle autonome og ikke-autonome celle virkninger. Sekund, genetisk manipulation ved hjælp af inducerbare systemer gør det muligt at sammenligne virkninger før eller efter synaptisk integration. Endvid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Defense (Idéudvikling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stamceller tilskud (AB), og en National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF). Det foreliggende materiale er baseret på arbejde delvis støttet af staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Dens indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter i staten Connecticut, Institut for Folkesundhed i staten Connecticut eller CT Innovations, havde Inc. finansieringskilder ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
