Neonatale subventriculaire zone Elektroporatie
Summary
We tonen een minimaal invasieve techniek genoemd neonatale subventriculaire zone elektroporatie. De techniek bestaat uit het injecteren plasmide DNA in de laterale ventrikels van neonatale pups en toepassen elektrische stroom te leveren en genetisch manipuleren neurale stamcellen
Abstract
Neurale stamcellen (NSC's) langs de postnatale laterale ventrikels en leiden tot verschillende celtypen die neuronen, astrocyten en ependymale cellen 1 omvatten. Inzicht in de moleculaire routes die verantwoordelijk zijn voor de NSC zelfvernieuwing, betrokkenheid, en differentiatie is van cruciaal belang voor het benutten van hun unieke potentieel om de hersenen te herstellen en beter te begrijpen het centraal zenuwstelsel. Eerdere methoden voor het manipuleren van zoogdiersystemen vereist de tijdrovende en dure onderneming van genetische manipulatie in het gehele dier level 2. Zo hebben de meeste studies onderzocht de functies van NSC moleculen in vitro of in ongewervelden.
Hier tonen we de eenvoudige en snelle techniek om neonatale NPCs die wordt aangeduid als neonatale subventriculaire zone (SVZ) elektroporatie manipuleren. Vergelijkbare technieken werden tien jaar geleden ontwikkeld om embryonale NSCs studeren en hebben geholpen studies over cortical ontwikkeling 3,4. Meer recent werd dit toegepast op de studie van de postnatale knaagdier voorhersenen 5-7. Deze techniek resulteert in robuuste etikettering van SVZ NSCs en hun nageslacht. Zo postnatale SVZ elektroporatie zorgt voor een kosten-en tijdbesparende alternatief voor zoogdieren NSC genetische manipulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier detail de techniek van neonatale SVZ elektroporatie, een techniek om snel en krachtig labelen en manipuleren SVZ stamcellen en hun nakomelingen. Er zijn verschillende voordelen die elektroporatie heeft in vergelijking met andere technieken. Eerste, gezien de focale kenmerken van cellen, een cel kan zelfstandige en niet-cell autonome effecten onderscheiden. Tweede genetische manipulatie met behulp van induceerbare systemen kan een vergelijking effecten vóór of na synaptische integratie. Verder kan een bypass het g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Defensie (Idee ontwikkeling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamcellen subsidie (AB) en een National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Inc De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit tot publicatie, of de bereiding van het manuscript.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurosciences. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
