CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup> +</supメラノーマから>推定されるがん幹細胞
Summary
この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133<sup> +</sup>推定メラノーマ幹細胞は、CD133から順にソートされ<sup> -</sup>磁気活性化細胞選別（MACS）を使用してバルク。
Abstract
利用できるメラノーマ今日のための改良さ治療オプションにもかかわらず、高度な悪性黒色腫の患者は、まだ無増悪生存期間および全生存期間のため予後不良である。したがって、トランスレーショナルリサーチは、悪性黒色腫のための標的療法を改善するためのさらなる分子の証拠を提供する必要があります。過去には、黒色腫に関連する発癌メカニズムが広く確立された細胞株を用いて検討した。個々の遺伝的プロファイルに基づいて、よりパーソナライズされた治療法への道に、私たちは、患者由来の細胞株の代わりに、汎用的な細胞株を使用することを提案する。特に患者のフォローアップ一緒に高品質の臨床データと、これらの細胞は、より良いメラノーマの進行の背後にある分子メカニズムを理解する手段になるでしょう。
ここでは、解剖した新鮮な腫瘍組織からの原発性メラノーマ培養の設立を報告している。この手順は、単一細胞にミンチと組織の解離、再を含む赤血球と線維芽細胞と同様に細胞の悪性黒色腫由来の初代培養で信頼性の検証と汚染のmoval。
最近の報告では、腫瘍の大部分のようなメラノーマ、港もっぱら転移状態に向かって腫瘍の発生と進行を煽るように見える癌幹細胞（CSCが）、少量の亜集団が明らかになった。黒色腫におけるCSCの同定および単離するための重要なマーカーの一つはCD133です。バルク、栽培と機能的に分析することができます–原発性黒色腫の培養液から、CD133 + CSCを単離するために、我々は、CD133の高い選別純度および生存率で+ CSCおよびCD133を生じMiltenyi社からの磁気活性化細胞選別（MACS）の手順を変更し、最適化したその後。
Introduction
皮膚の悪性黒色腫は皮膚癌の最も一般的でない、まだ最も致命的なタイプです。増加率、死亡の1,2に関連悪性皮膚腫瘍の75％は悪性腫瘍であり、急速な普及のハイグレード、今やメラノーマアカウントが原因。原発腫瘍の外科的切除、化学療法、放射線療法、免疫療法と組み合わせた化学療法と転移性黒色腫の免疫療法に加えメラノーマ治療3,4の最先端の戦略があります。しかし、悪性黒色腫は化学療法への反応が不良（5-12％）、5,6、およびのみvemurafenib 7〜による治療などの新しい標的治療に有望からBRAF V600E遺伝子変異の利益を運ぶメラノーマ患者のものと50から70パーセントによって特徴付けられる全生存期間を改善し、メラノーマ腫瘍形成のメカニズムのより良い理解が必要である。
過去には、十分に確立された商業でそれらのメカニズムを研究するために、cially可能な細胞株を用いた。がんの発生と進行の分子事象を研究するための、より最近のアプローチは、腫瘍組織に直接由来初代培養活用 – 戦略ベアリングマニホールドの利点を：研究者は、患者と組織選択の完全なコントロールを持っています。サンプリングされた細胞は巧妙に選ば腫瘍組織から得られた、そのすべての異質性腫瘍に似ているとフォローアップの患者のデータと詳細な病理学は、文化の特性は元の腫瘍8のものと比較することを許容するために利用可能です。
これとは対照的に、がん研究における関連モデルシステムとして確立された細胞株の使用は論争議論されている。すでに1987年にオズボーンらは異なる研究室9からMCF-7ヒト乳癌細胞株の間に有意な生物学的な違いについて説明しました。継代中のRNA発現のこの大規模なゲノム不安定性とバリエーションが共同であったHiorns らによるnfirmed。および細胞株は、それによってヒト癌10のモデルのような確立された文化の直接の関連性を弱める、文化の中で進化しないという証拠のための支援データを提供した。
大部分は長年にわたって無視されてきたもう一つの重要な考慮事項は、最初の細胞株の多数がHeLaによって汚染されたことを実証することによって、20年以上前に強調表示されていた無関係の 'false'細胞と培養液の汚染や増殖のリスクである細胞8,11。 'false'の細胞株からのデータの誤った解釈は、最近になって再び文学で明るみになってきた。 DNAプロファイリングと分子細胞遺伝学の組み合わせを使用して、マクラウドらは 252の新しい腫瘍由来のヒト細胞株の、微生物や培養細胞（DSMZ）のドイツCollectionに寄託ほぼ18％が種内であることが判明したまたはクロス種差ことを明らかにした·汚染物質12,13。
これらの問題を回避するためと、上記の利点を活用するために、我々は新たに摘出転移からの低通路メラノーマ細胞株を樹立することを決めた。
強固な細胞分離·解析技術は、同時に特徴的な表面のタンパク質の細胞死と破壊を制限しながら、単一セルの準備が生成する必要があります。単細胞懸濁液中に組織の解離のための自動化されたベンチトップ測定器は、ミルテニー製gentleMACSの解離です。抗原エピトープを維持し、セル損失を低減しつつ、gentleMACS Cチューブ、最適化された解離ソリューションと組み合わせて使用すると、クローズドシステム内の腫瘍組織の効果的かつ穏やかな解離が達成される。楽器は、特定のアプリケーションや保証で即時メラノーマ組織14から単細胞懸濁液の標準製剤の様々な最適化され、あらかじめ設定されたプログラムを提供しています。
<Pクラス= "jove_content">最近の報告では、腫瘍の大部分が専ら腫瘍の開始と自己再生能力発揮いわゆる癌幹細胞（CSCが）の小集団を抱いていることを明らかにした。皮膚の真皮にメラノサイト産生幹細胞の同定はUVA放射への曝露が悪性形質転換15のためにこれらの細胞を準備することができるので、これらの細胞がメラノーマにおける癌幹細胞（CSCが）の原点かもしれないという仮説につながった。このような遺伝的病変の結果は、腫瘍と幹細胞の特性の組み合わせを抱い細胞であろう。メラノーマでCSCの亜集団を表現するために提案された重要なマーカーの一つは、CD133の16から20です。 CD133（またプロミニン1とも呼ばれます）、pentaspan膜貫通糖タンパク質のメンバーは、造血幹細胞、内皮前駆細胞、ニューロンおよびグリア幹細胞21から23で表されます。 CD133の発現と相関している非対称細胞分裂24、CD133のグリコシル化エピトープが細胞分化25時にダウンレギュレートすることが示された。最近では、CD133 +メラノーマ細胞は自己複製および腫瘍イニシエーション容量19,20を有することが示された。
細胞– CD133の機能+推定メラノーマCSCを勉強するために、我々は、CD133 +およびCD133の高濃縮および生存個体を得るためにミルテニーバイオテクから磁気活性化細胞選別（MACS）システムを変更し、最適化しました。
Matheu らによって示されているように磁気ビーズベースの細胞分離はどちら負の選択が可能になります26、または正の選択我々がここで示しているよう。正の選択中に特定の標的細胞型、 例えば CD133発現する細胞は、磁気に対して非常に特異的な抗体に結合しているMicroBeadsは、50 nmの超常磁性粒子で標識されている特定の細胞表面抗原。非標識細胞が通って流れるのに対し分離中、磁気標識した細胞は、セパレータの磁場中でカラム内に保持されています。洗浄工程の後、カラムセパレータの磁場から削除され、標的細胞をカラムから溶出される。 LSまたはMSカラムは、高純度の標識および非標識細胞の分画における正の選択の結果の間に使用。一方、負の選択に使用されるLDの列、、標識された画分の純度が若干低い結果。その行列のパッキング密度が高いのために、これらの列の流量は、カラムの中に閉じ込められる非標識細胞のリスクが高い低いに起因している。 LDの列は、望ましくない細胞亜集団の厳しいプリーションするためにのみ使用する必要があります。ポジティブ選択incubatio以下MicroBeadsで直接（MicroBeadsに結合した抗体）または間接磁気標識（インキュベーションによって行うことができるn個の一次抗体を使用）。特定のMACS MicroBeadsは前立腺または黒色腫27のような原発腫瘍細胞の多くの種類の細胞の正の選択のために用意されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍細胞ペレットから赤血球汚染を除去するために、我々は非常にミルテニーから赤血球細胞溶解液の使用をお勧めします。伝統的なフィコール密度勾配遠心分離の上赤血球を溶解することの利点は、それがより速く、より簡単であることです。さらに、フィコールまたは赤血球細胞と腫瘍細胞の喪失と汚染が回避されます。長すぎる待っているとき、彼らは通常、腫瘍細胞がはびこるので?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者はこの仕事をサポートし、批判的に原稿を読み取るための教授M. Dietelとディルク·シューマッハに感謝します。
これらの結果につながる研究は助成合意nは下革新的医薬品イニシアティブの共同事業からの支持を受けています°の115234は、リソースは、欧州連合（EU）の第7次フレームワークプログラム（FP7/2007-2013）とEFPIA会社の中から拠出金で構成されています現物出資。この作品はまた、ベルリンKrebsgesellschaft（BKG）によってサポートされていました。
Materials
| Reagent | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
| D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
| Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Equipment | |||
| Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
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