Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133⁺ Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Summary

Este artigo descreve a preparação do tecido acabado de melanoma obtidas em culturas primárias de células, e como para remover contaminações de eritrócitos e fibroblastos a partir de células tumorais. Finalmente, descrevemos como CD133⁺ De células estaminais putativas de melanoma são classificados do CD133^- Massa usando separação celular magnética activado (MACS).

Abstract

Apesar de melhores opções de tratamentos para o melanoma disponível hoje, os pacientes com melanoma maligno avançado ainda tem um prognóstico ruim de sobrevivência livre de progressão e global. Portanto, a pesquisa translacional precisa fornecer mais evidências molecular para melhorar terapias direcionadas para melanomas malignos. No passado, os mecanismos de oncogénicos relacionadas com melanoma foram extensivamente estudados em linhas celulares estabelecidas. No caminho para tratamentos mais personalizados baseados em perfis genéticos individuais, propomos usar linhas celulares derivadas paciente em vez de linhas celulares genéricos. Juntamente com os dados clínicos de alta qualidade, especialmente no acompanhamento do paciente, essas células serão fundamentais para compreender melhor os mecanismos moleculares por trás de progressão do melanoma.

Aqui, nós relatamos o estabelecimento de culturas primárias de melanoma tecido tumoral dissecados fresco. Este procedimento inclui a trituração ea dissociação do tecido em células individuais re,moval de contaminação com eritrócitos e fibroblastos, bem como de cultura primária e uma verificação fiável da origem das células de melanoma.

Relatórios recentes revelaram que melanomas, como a maioria dos tumores, porto uma pequena subpopulação de células-tronco cancerosas (CSCS), que parecem alimentar exclusivamente de iniciação e progressão tumoral em direção ao estado metastático. Um dos marcadores essenciais para a identificação e isolamento de CSC no melanoma é CD133. Para isolar CD133 ⁺ CSCs a partir de culturas primárias de melanoma, temos modificado e optimizado a separação de células magnético-Activated (MACS) procedimento de Miltenyi resultando em pureza elevada e classificação viabilidade de CD133 ⁺ CSCs e CD133 ^{– a} granel, que podem ser cultivados e analisados ​​funcionalmente depois disso.

Introduction

Melanomas malignos cutâneos são o tipo menos comum, mas mais letal de câncer de pele. Devido a uma incidência crescente, um alto grau de malignidade e uma rápida disseminação, melanomas, hoje, representam 75% dos tumores malignos de pele relacionadas com ^1,2 mortes. Além de excisão cirúrgica do tumor primário, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e quimioterapia combinada e imunoterapia de melanoma metastático são as estratégias de estado-da-arte para o tratamento de melanoma ^3,4. No entanto, o melanoma maligno é caracterizado por uma má resposta à quimioterapia (5-12%) ^5,6, e apenas os 50-70% dos pacientes com melanoma que carregam o BRAF V600E benefício mutação genética do prometendo novas terapias-alvo como o tratamento com vemurafenib ⁷ Para melhorar a sobrevida global, uma melhor compreensão dos mecanismos de tumorigênese melanoma é necessário.

Para estudar estes mecanismos, no passado, comercialmente bem estabelecidacialmente disponíveis linhas celulares foram usados. Abordagens mais recentes para estudar os eventos moleculares de iniciação e progressão do câncer utilizam culturas primárias derivadas diretamente de tecido do tumor – uma estratégia benefícios múltiplos de rolamento: O pesquisador tem controle total do paciente e seleção de tecidos. As células da amostra obtida a partir habilmente seleccionados tecido do tumor, o tumor se assemelham com toda a sua heterogeneidade e dados de seguimento do paciente e uma patologia detalhadas estão disponíveis para permitir que as características da cultura a ser comparados com aqueles do tumor original ^8.

Em contraste, a utilização de linhas celulares estabelecidas, como sistemas modelo relevantes na investigação do cancro é discutida de forma controversa. Já em 1987 Osborne e colegas descreveram significativas diferenças biológicas entre MCF-7 de mama humano linhas celulares de cancro de diferentes laboratórios ^9. Esta instabilidade genómica e extensa variação na expressão de RNA durante a subcultura foi confirmed por Hiorns et al. e forneceram dados de apoio à evidência de que as linhas de células evoluem na cultura, enfraquecendo assim a relevância direta de tais culturas estabelecidas como modelos de câncer humano ^10.

Outra consideração importante, que tem sido largamente ignorado ao longo dos anos, o risco de contaminação ou crescimento de culturas não relacionadas com as células "falsos", que foi pela primeira vez destacadas mais de vinte anos atrás, demonstrando que um grande número de linhas de células HeLa foram contaminadas pelos células ^8,11. A má interpretação de dados de "falsos" linhas celulares recentemente veio à luz na literatura novamente. Usando uma combinação de perfis de ADN e citogenética molecular, MacLeod et ai. Revelou que de 252 novos derivadas de tumor de linhas de células humanas depositados na Colecção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (DSMZ), cerca de 18% foram consideradas intra-espécies ou interespécies cruz -contaminantes ^12,13.

Para evitar estes problemas e para fazer uso das vantagens acima mencionadas, decidimos estabelecer passagem baixa as linhas de células de melanoma a partir de metástases recentemente excisadas.

Tecnologias de células robustas de separação e análise exigem unicelulares preparações a serem gerados ao mesmo tempo, limitar a morte celular e a destruição das proteínas de superfície característicos. Um instrumento de bancada para a dissociação automatizado de tecidos em suspensões de célula única é o dissociador gentleMACS fabricado pela Miltenyi. Quando utilizado em combinação com tubos gentleMACS C e dissociação optimizado soluções, uma dissociação eficaz e suave do tecido do tumor, num sistema fechado é conseguido preservando epítopos de antigénios e reduzindo a perda de células. O instrumento dispõe optimizados, os programas pré-estabelecidos para uma variedade de aplicações específicas e garantias preparação padronizada de suspensões unicelulares a partir de tecido de melanoma ^14.

<p class = "jove_content"> Relatórios recentes revelaram que a maioria dos tumores de abrigar uma pequena subpopulação de células cancerosas chamados estaminais (CSCs), os quais apresentam exclusivamente tumor de iniciação e capacidade de auto-renovação. A identificação das células de melanócitos produtoras de tronco na derme da pele levou à hipótese de que estas células podem ser a origem das células de cancro da haste (CSCs) em melanoma vez que a exposição à radiação UVA podem preparar estas células para a transformação maligna ^15. O resultado de tal lesão genética seriam as células que abrigam uma combinação de características de tumor e de células estaminais.

Um dos marcadores chave proposto para representar a subpopulação de CSCs em melanoma é CD133 ^16-20. CD133 (também conhecido como Prominin 1), um membro de glicoproteínas transmembranares pentaspan, é expresso em células progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras endoteliais, células estaminais neuronais e gliais ^21-23. A expressão de CD133 está correlacionada com adivisão celular assimétrica ^24, e do epítopo glicosilada de CD133 mostrou ser downregulated upon a diferenciação das células ^25. Recentemente, CD133 ⁺ de melanoma foram mostrados para ter auto-renovação e tumor de iniciação capacidade ^19,20.

Para estudar a função das células CD133 ⁺ putativo melanoma CSCs, modificamos e otimizou a separação celular magnética Ativado (MACS), sistema de Miltenyi Biotech obter populações altamente enriquecido e viáveis ​​de CD133 ⁺ e CD133 ^– células.

Separação magnética de células grânulo-based permite para qualquer seleção negativa, como mostrado por Matheu et al. ²⁶ ou seleção positiva como mostramos aqui. Durante a selecção positiva do tipo de célula alvo específico, por exemplo, as células que expressam CD133, é magneticamente marcadas com micro-esferas, partículas de 50 nm que são superparamagnéticas conjugados com anticorpos altamente específicos contra umo antigénio de superfície celular específico. Durante a separação, as células magneticamente marcadas são retidas no interior da coluna no campo magnético do separador, enquanto que as células não marcadas fluir. Seguindo os passos de lavagem, a coluna é removida do campo magnético do separador, e as células alvo são eluídos a partir da coluna. O LS ou colunas MS utilizada durante a sequência de selecção positiva em fracções de células marcadas e não marcadas com elevado grau de pureza. Por outro lado, as colunas de LD, usado para a selecção negativa, resultam em uma pureza ligeiramente inferior a fracção marcada. Devido à densa embalagem da sua matriz a taxa de fluxo nestas colunas é mais baixa resultante de um risco maior de células não marcadas para serem retidas na coluna. Colunas LD deve, portanto, ser utilizado apenas para a depleção rigoroso de uma subpopulação de células não desejados. Selecção positiva pode ser realizada por directa (anticorpo acoplado a microesferas) ou indirecta rotulagem magnética (incubação com microesferas após a incubation com o anticorpo primário). Microesferas MACS específicos estão disponíveis para a selecção positiva de numerosos tipos de células primárias de células de tumor da próstata, como melanoma ou ^27.

Protocol

O esquema geral da experiência, incluindo a preparação de primários de um único células de tecido de tumor, a caracterização da cultura celular primária, a depleção de células de fibroblastos e de triagem magnética de CD133 CD133 + e – células de melanoma é mostrado na Figura 1. 1. Aquisição Amostra Verifique para aprovação ética antes de considerar os próximos passos. Prepare um tubo de 50 ml com PBS estéril s…

Representative Results

Preparação de células de um único tecido tumoral A Figura 2 exemplifica uma ressecado metástase de nódulo linfático de um paciente de melanoma fase final antes (A) e depois (B) de dissociação mecânica em 2-4 pedaços mm. Seguindo dissociação enzimática do tecido e filtração através de uma malha de nylon de 70 um, as células foram sedimentadas e o sobrenadante foi descartado. Nesta etapa foi observada uma elevada contaminação com eritrócitos, como indicado pe…

Discussion

A fim de eliminar contaminações de eritrócitos do tumor pellet celular recomendamos usar o vermelho sangue solução de lise celular de Miltenyi. As vantagens de lisar os eritrócitos durante a centrifugação em gradiente de Ficoll tradicional densidade são que é mais rápida e mais simples. Além disso, as contaminações com Ficoll ou glóbulos vermelhos do sangue e da perda de células tumorais são evitados. Quando se observa o crescimento de fibroblastos em cultura primária de células que deve ser removido …

Materials

			Reagent
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Collagenase IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg	PAA Laboratories GmbH	H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
			Equipment
Cell strainer (70 μm)	BD Biosciences	352350
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
Natriumchloride	Merck KGaA	567440-1KG
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES)	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE