מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד CD133<sup> +</sup> תאי גזע מלנומה משוערים ממוינים מCD133<sup> -</sup> כמות גדולה באמצעות מיון מגנטי הופעל סלולרי (MACS).
למרות אפשרויות טיפולים משופרות עבור מלנומה זמין היום, חולים עם מלנומה ממאירה מתקדמת עדיין יש פרוגנוזה גרועה להישרדות ללא התקדמות וכוללת. לכן, מחקר translational צריך לספק ראיות מולקולריות נוסף כדי לשפר את הטיפולים ממוקדים עבור מלנומה ממאיר. במנגנונים האחרונים, שהעור הקשורים ללנומה נחקרו בהרחבה בשורות תאים ותיקות. בדרך למשטרי טיפול מותאמים אישית המבוססים על פרופיל גנטי אישי, אנו מציעים להשתמש בשורות תאי חולה המופקים במקום קווים סלולריים גנריות. יחד עם נתוני איכות גבוהות קליניים, במיוחד על מעקב מטופל, תאים אלה יהיו סייעו כדי להבין טובים יותר את המנגנונים המולקולריים מאחורי התקדמות מלנומה.
כאן, אנו מדווחים על הקמת תרבויות מלנומה ראשוניות מרקמת גידול טריה גזורה. הליך זה כולל ריסוק וניתוק של הרקמה לתאים בודדים, מחדשmoval של זיהומים עם אריתרוציטים ופיברובלסטים, כמו גם תרבות ראשונית ואימות אמינה ממוצא מלנומה של התאים.
הדיווחים האחרונים עולים כי מלנומה, כמו מרבית גידולים, נמל subpopulation קטן של תאי גזע סרטני (CSCS), אשר נראו באופן בלעדי לתדלוק ייזום והתקדמות גידול כלפי המדינה גרורתי. אחד הסמנים המרכזיים לזיהוי ובידוד CSC מלנומה הוא CD133. כדי לבודד CD133 + CSCS מתרבויות מלנומה העיקריות, יש לנו שונים ומותאם המיון מגנטי הופעל הסלולריים (MACS) הליך מMiltenyi כתוצאה טוהר מיון גבוה וכדאיות של CD133 + CSCS וCD133 – בתפזורת, שיכול להיות מתורבת ותפקודי נותח לאחר מכן.
מלנומה ממאיר עורית הם הסוג הפחות שכיח, אך קטלני ביותר של סרטן העור. בשל שכיחות גוברת, ציון גבוה של ממאירות והפצה מהירה, מלנומה כעת חשבון עבור 75% מגידולי עור ממאירים הקשורים 1,2 מקרי מוות. מלבד כריתה כירורגית של גידול הראשוני, כימותרפיה, הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה והטיפול החיסוני המשולב של מלנומה עם גרורות הן אסטרטגיות מדינה-of-the-art לטיפול במלנומה 3,4. עם זאת, מלנומה ממאיר מאופיין בתגובה ירודה לchemotherapeutics (5-12%) 5,6, ורק אלה 50-70% מחולים מלנומה הנושאים את המוטציה בגן יתרון V600E BRAF ממבטיח טיפולים ממוקדים חדשים כטיפול עם 7 vemurafenib כדי לשפר את ההישרדות כוללת, הבנה טובה יותר של המנגנונים של tumorigenesis לנומה היא זקוקות.
ללמוד המנגנונים האלה בcommer העבר, המבוסס היטבשורות תאי cially זמינות היו בשימוש. גישות מאוחרות יותר כדי לחקור את האירועים המולקולריים של ייזום הסרטן וההתקדמות לנצל תרבויות עיקריות הנגזרות ישירות מרקמת גידול – יתרונות סעפת נושאי אסטרטגיה: החוקר יש שליטה מלאה של מטופל ובחירת רקמות. התאים שנדגמו נרכשו מרקמת גידול שנבחר במומחיות, דומה גידול עם כל ההטרוגניות שלה ומעקב נתונים של המטופל ופתולוגיות מפורטות זמינים כדי לאפשר את המאפיינים של התרבות שיש בהשוואה לאלו של גידול המקורי 8.
בניגוד לכך, השימוש בשורות תאים הוקמו כמערכות מודל רלוונטיות בחקר הסרטן נדון שנוי במחלוקת. כבר בשנת 1987 אוסבורן ועמיתים תארו הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין קווי MCF-7 אדם תאי סרטן שד ממעבדות שונות 9. חוסר יציבות זו נרחבת גנומי ווריאציה בביטוי RNA במהלך תת היה שותףnfirmed ידי Hiorns et al. וספק נתונים תומכים לראיות ששורות תאים אל להתפתח בתרבות, ובכך להחליש את הרלוונטיות הישירות של תרבויות מבוססות כמו מודלים של הסרטן האנושי 10.
שיקול חשוב נוסף, אשר במידה רבה כבר התעלם במשך השנים, הוא הסיכון לזיהום או צמיחת יתר של תרבויות עם תאים שאינם קשורים 'שווא', שהיה מודגש ראשון מעל לפני עשרים שנה על ידי הוכחה כי מספר רב של שורות תאים היו מזוהם על ידי הלה תאים 8,11. הפירוש לא הנכון של נתונים משורות תאים "לא צודק" הגיע לאחרונה לאור בספרות שוב. באמצעות שילוב של פרופיל ה-DNA וציטוגנטיקה מולקולרית, מקלאוד et al. חשף כי מתוך 252 שורות תאים אנושיות חדשות המופקות מגידול הופקד באוסף הגרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSMZ), כמעט 18% נמצאו intraspecies או interspecies צלב מזהמים-12,13.
כדי להימנע מבעיות אלה ולעשות שימוש ביתרונות שהוזכרו לעיל, החלטנו להקים שורות תאים מלנומה, מעבר נמוך מגרורות כרותות טרי.
טכנולוגיות הפרדה וניתוח סלולריים חזקות דורשות הכנות תא בודד שנוצרו תוך הגבלת מוות של תאים והרס של חלבוני שטח אופייניים. מכשיר benchtop לניתוק האוטומטי של רקמות להשעיות תא בודד הוא Dissociator gentleMACS מיוצר על ידי Miltenyi. כאשר משתמשים בשילוב עם gentleMACS C צינורות ופתרונות אופטימיזציה דיסוציאציה, ניתוק יעיל ועדין של רקמת גידול במערכת סגורה מושגת תוך שמירת אפיטופים אנטיגן וצמצום אובדן תא. המכשיר מציע תוכניות מותאמות, שנקבעו מראש עבור מגוון רחב של יישומים וערבויות הכנה סטנדרטית של השעיות תא בודד מרקמות מלנומה 14 ספציפיים.
<כיתת p = "jove_content"> הדיווחים האחרונים עולים כי רוב גידולי נמל subpopulation קטן של תאי הגזע סרטני שנקראו (CSCS), אשר באופן בלעדי תערוכת ייזום-גידול עצמי וחידוש בקיבולת. זיהוי של תאי גזע מלנוציט לייצור בדרמיס של העור הוביל להשערה כי תאים אלה עשויים להיות המקור של תאי גזע סרטני (CSCS) מלנומה מאז חשיפה לקרינת UVA יכולה להכין תאים אלה לשינוי ממאיר 15. התוצאה של פגיעה גנטית שכזה תהיה תאים כי נמל שילוב של גידול ובמאפיינים של תאי גזע.אחד מסמני המפתח שהוצעו לייצג את תת האוכלוסיות של CSCS במלנומה הוא CD133 16-20. CD133 (הידוע גם כ1 Prominin), חבר של גליקופרוטאינים הטרנסממברני pentaspan, מתבטא בתאי גזע, תאי hematopoietic אנדותל, תאי גזע עצביים וגליה 21-23. ביטוי של CD133 מתואם עםחלוקה סימטרית תא 24, וepitope המסוכר של CD133 הוצגה להיות downregulated על התמיינות תא 25. לאחרונה, CD133 + תאים מלנומה, הראו לי התחדשות עצמית ויכולת גידול ייזום 19,20.
כדי לחקור את תפקידו של CD133 + המשוער לנום CSCS, יש לנו שונים ומותאם למערכת המיון מגנטי הופעל הסלולרי (MACS) מMiltenyi יוטק להשיג אוכלוסיות מועשרות ובת הקיימא ביותר של CD133 + וCD133 – תאים.
הפרדת תא חרוז מבוסס מגנטית מאפשרת גם סלקציה שלילית כפי שמוצג על ידי Matheu et al. 26 או סלקציה חיובית כפי שאנו מציגים כאן. במהלך סלקציה חיובית סוג מסוים יעד התא, למשל CD133 תאים לבטא, מתויג מגנטי עם microbeads, חלקיקים פאראמגנטי 50-nm שמצומד לנוגדנים הספציפיים ביותר נגדאנטיגן תא שטח מסוים. במהלך הפרדה, התאים שהכותרת מגנטית נשמרים בתוך העמודה בשדה המגנטי של המפריד, ואילו תאים ללא תווית לזרום. בעקבות צעדי כביסה, העמודה תוסר מהשדה המגנטי של המפריד, ואת תאי יעד eluted מהעמודה. עמודות MS LS או שימוש במהלך בחירת תוצאה החיובית בשברים של תאים שכותרת וללא תווית עם טוהר גבוה. מצד השני, עמודות LD, המשמשות לסלקציה שלילית, מביא לטוהר מעט נמוך יותר של החלק המסומן. בשל צפוף אריזה של המטריצה שלהם את קצב הזרימה בעמודות אלה הוא נמוכים וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של תאים ללא תווית כדי להיות לכוד בעמודה. עמודות LD לכן יש להשתמש רק לדלדול חמור של תת אוכלוסיות של תאים לא רצויות. סלקציה חיובית יכולה להתבצע על ידי תיוג מגנטי ישיר (נוגדן מצמיד microbeads) או עקיף (דגירה עם microbeads בעקבות incubation עם הנוגדן הראשוני). Microbeads מקים מסוים זמינים לסלקציה החיובית של תאים מסוגים רבים של תאים סרטניים ראשוניים כמו ערמונית או מלנומה 27.
על מנת להסיר זיהומים כדוריים אדומים מתא גלולת גידול מומלץ מאוד להשתמש בפתרון תמוגה תא הדם האדום מMiltenyi. היתרונות של lysing את אריתרוציטים מעל צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll המסורתית הם כי הוא מהיר יותר ופשוט יותר. יתר על כן, עם זיהומי Ficoll או תאי דם אדומים ואובדן של תאים סרטני?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לפרופ 'מ Dietel ודירק שומאכר לתמיכה בעבודה זו ובביקורתיות קרא את כתב היד.
המחקר שיוביל לתוצאות אלה קבל תמיכה מההתחייבות החדשנית תרופות היוזמה המשותפת תחת הסכם המענק n ° 115234, משאבים של אשר מורכבים של תרומה כספית מהתכנית השביעית של האיחוד האירופי Framework (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA 'ב תרומה נדיבה. עבודה זו נתמכה גם על ידי ברלינר Krebsgesellschaft (BKG).
Reagent | |||
Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
anti-fibroblasts microbeads | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
CD133/1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
Collagenase IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
DNase I | Applichem GmbH | A3778.0050 | |
D-PBS without Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent |
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
Equipment | |||
Cell strainer (70 μm) | BD Biosciences | 352350 | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
MACS Separator Multi Stand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
MACS Seperation Columns 25 LS Columns | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
Pre-Separation Filters | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
Steritop-GP Filter Unit 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |