תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133⁺ תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Summary

מאמר זה מתאר את ההכנה של רקמה המתקבלת מלנומה טרי לתרבויות העיקריות של תאים, וכיצד להסיר זיהומים של אריתרוציטים ופיברובלסטים מתאי הגידול. לבסוף, אנו מתארים כיצד CD133⁺ תאי גזע מלנומה משוערים ממוינים מCD133^- כמות גדולה באמצעות מיון מגנטי הופעל סלולרי (MACS).

Abstract

למרות אפשרויות טיפולים משופרות עבור מלנומה זמין היום, חולים עם מלנומה ממאירה מתקדמת עדיין יש פרוגנוזה גרועה להישרדות ללא התקדמות וכוללת. לכן, מחקר translational צריך לספק ראיות מולקולריות נוסף כדי לשפר את הטיפולים ממוקדים עבור מלנומה ממאיר. במנגנונים האחרונים, שהעור הקשורים ללנומה נחקרו בהרחבה בשורות תאים ותיקות. בדרך למשטרי טיפול מותאמים אישית המבוססים על פרופיל גנטי אישי, אנו מציעים להשתמש בשורות תאי חולה המופקים במקום קווים סלולריים גנריות. יחד עם נתוני איכות גבוהות קליניים, במיוחד על מעקב מטופל, תאים אלה יהיו סייעו כדי להבין טובים יותר את המנגנונים המולקולריים מאחורי התקדמות מלנומה.

כאן, אנו מדווחים על הקמת תרבויות מלנומה ראשוניות מרקמת גידול טריה גזורה. הליך זה כולל ריסוק וניתוק של הרקמה לתאים בודדים, מחדשmoval של זיהומים עם אריתרוציטים ופיברובלסטים, כמו גם תרבות ראשונית ואימות אמינה ממוצא מלנומה של התאים.

הדיווחים האחרונים עולים כי מלנומה, כמו מרבית גידולים, נמל subpopulation קטן של תאי גזע סרטני (CSCS), אשר נראו באופן בלעדי לתדלוק ייזום והתקדמות גידול כלפי המדינה גרורתי. אחד הסמנים המרכזיים לזיהוי ובידוד CSC מלנומה הוא CD133. כדי לבודד CD133 ⁺ CSCS מתרבויות מלנומה העיקריות, יש לנו שונים ומותאם המיון מגנטי הופעל הסלולריים (MACS) הליך מMiltenyi כתוצאה טוהר מיון גבוה וכדאיות של CD133 ⁺ CSCS וCD133 ^– בתפזורת, שיכול להיות מתורבת ותפקודי נותח לאחר מכן.

Introduction

מלנומה ממאיר עורית הם הסוג הפחות שכיח, אך קטלני ביותר של סרטן העור. בשל שכיחות גוברת, ציון גבוה של ממאירות והפצה מהירה, מלנומה כעת חשבון עבור 75% מגידולי עור ממאירים הקשורים ^1,2 מקרי מוות. מלבד כריתה כירורגית של גידול הראשוני, כימותרפיה, הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה והטיפול החיסוני המשולב של מלנומה עם גרורות הן אסטרטגיות מדינה-of-the-art לטיפול במלנומה ^3,4. עם זאת, מלנומה ממאיר מאופיין בתגובה ירודה לchemotherapeutics (5-12%) ^5,6, ורק אלה 50-70% מחולים מלנומה הנושאים את המוטציה בגן יתרון V600E BRAF ממבטיח טיפולים ממוקדים חדשים כטיפול עם ⁷ vemurafenib כדי לשפר את ההישרדות כוללת, הבנה טובה יותר של המנגנונים של tumorigenesis לנומה היא זקוקות.

ללמוד המנגנונים האלה בcommer העבר, המבוסס היטבשורות תאי cially זמינות היו בשימוש. גישות מאוחרות יותר כדי לחקור את האירועים המולקולריים של ייזום הסרטן וההתקדמות לנצל תרבויות עיקריות הנגזרות ישירות מרקמת גידול – יתרונות סעפת נושאי אסטרטגיה: החוקר יש שליטה מלאה של מטופל ובחירת רקמות. התאים שנדגמו נרכשו מרקמת גידול שנבחר במומחיות, דומה גידול עם כל ההטרוגניות שלה ומעקב נתונים של המטופל ופתולוגיות מפורטות זמינים כדי לאפשר את המאפיינים של התרבות שיש בהשוואה לאלו של גידול המקורי ^8.

בניגוד לכך, השימוש בשורות תאים הוקמו כמערכות מודל רלוונטיות בחקר הסרטן נדון שנוי במחלוקת. כבר בשנת 1987 אוסבורן ועמיתים תארו הבדלים ביולוגיים משמעותיים בין קווי MCF-7 אדם תאי סרטן שד ממעבדות שונות ^9. חוסר יציבות זו נרחבת גנומי ווריאציה בביטוי RNA במהלך תת היה שותףnfirmed ידי Hiorns et al. וספק נתונים תומכים לראיות ששורות תאים אל להתפתח בתרבות, ובכך להחליש את הרלוונטיות הישירות של תרבויות מבוססות כמו מודלים של הסרטן האנושי ^10.

שיקול חשוב נוסף, אשר במידה רבה כבר התעלם במשך השנים, הוא הסיכון לזיהום או צמיחת יתר של תרבויות עם תאים שאינם קשורים 'שווא', שהיה מודגש ראשון מעל לפני עשרים שנה על ידי הוכחה כי מספר רב של שורות תאים היו מזוהם על ידי הלה תאים ^8,11. הפירוש לא הנכון של נתונים משורות תאים "לא צודק" הגיע לאחרונה לאור בספרות שוב. באמצעות שילוב של פרופיל ה-DNA וציטוגנטיקה מולקולרית, מקלאוד et al. חשף כי מתוך 252 שורות תאים אנושיות חדשות המופקות מגידול הופקד באוסף הגרמני של מיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSMZ), כמעט 18% נמצאו intraspecies או interspecies צלב ^{מזהמים-12,13.}

כדי להימנע מבעיות אלה ולעשות שימוש ביתרונות שהוזכרו לעיל, החלטנו להקים שורות תאים מלנומה, מעבר נמוך מגרורות כרותות טרי.

טכנולוגיות הפרדה וניתוח סלולריים חזקות דורשות הכנות תא בודד שנוצרו תוך הגבלת מוות של תאים והרס של חלבוני שטח אופייניים. מכשיר benchtop לניתוק האוטומטי של רקמות להשעיות תא בודד הוא Dissociator gentleMACS מיוצר על ידי Miltenyi. כאשר משתמשים בשילוב עם gentleMACS C צינורות ופתרונות אופטימיזציה דיסוציאציה, ניתוק יעיל ועדין של רקמת גידול במערכת סגורה מושגת תוך שמירת אפיטופים אנטיגן וצמצום אובדן תא. המכשיר מציע תוכניות מותאמות, שנקבעו מראש עבור מגוון רחב של יישומים וערבויות הכנה סטנדרטית של השעיות תא בודד מרקמות מלנומה ¹⁴ ספציפיים.

<כיתת p = "jove_content"> הדיווחים האחרונים עולים כי רוב גידולי נמל subpopulation קטן של תאי הגזע סרטני שנקראו (CSCS), אשר באופן בלעדי תערוכת ייזום-גידול עצמי וחידוש בקיבולת. זיהוי של תאי גזע מלנוציט לייצור בדרמיס של העור הוביל להשערה כי תאים אלה עשויים להיות המקור של תאי גזע סרטני (CSCS) מלנומה מאז חשיפה לקרינת UVA יכולה להכין תאים אלה לשינוי ממאיר ^15. התוצאה של פגיעה גנטית שכזה תהיה תאים כי נמל שילוב של גידול ובמאפיינים של תאי גזע.

אחד מסמני המפתח שהוצעו לייצג את תת האוכלוסיות של CSCS במלנומה הוא CD133 ^16-20. CD133 (הידוע גם כ1 Prominin), חבר של גליקופרוטאינים הטרנסממברני pentaspan, מתבטא בתאי גזע, תאי hematopoietic אנדותל, תאי גזע עצביים וגליה ^21-23. ביטוי של CD133 מתואם עםחלוקה סימטרית תא ^24, וepitope המסוכר של CD133 הוצגה להיות downregulated על התמיינות תא ^25. לאחרונה, CD133 ⁺ תאים מלנומה, הראו לי התחדשות עצמית ויכולת גידול ייזום ^19,20.

כדי לחקור את תפקידו של CD133 ⁺ המשוער לנום CSCS, יש לנו שונים ומותאם למערכת המיון מגנטי הופעל הסלולרי (MACS) מMiltenyi יוטק להשיג אוכלוסיות מועשרות ובת הקיימא ביותר של CD133 ⁺ וCD133 ^– תאים.

הפרדת תא חרוז מבוסס מגנטית מאפשרת גם סלקציה שלילית כפי שמוצג על ידי Matheu et al. ²⁶ או סלקציה חיובית כפי שאנו מציגים כאן. במהלך סלקציה חיובית סוג מסוים יעד התא, למשל CD133 תאים לבטא, מתויג מגנטי עם microbeads, חלקיקים פאראמגנטי 50-nm שמצומד לנוגדנים הספציפיים ביותר נגדאנטיגן תא שטח מסוים. במהלך הפרדה, התאים שהכותרת מגנטית נשמרים בתוך העמודה בשדה המגנטי של המפריד, ואילו תאים ללא תווית לזרום. בעקבות צעדי כביסה, העמודה תוסר מהשדה המגנטי של המפריד, ואת תאי יעד eluted מהעמודה. עמודות MS LS או שימוש במהלך בחירת תוצאה החיובית בשברים של תאים שכותרת וללא תווית עם טוהר גבוה. מצד השני, עמודות LD, המשמשות לסלקציה שלילית, מביא לטוהר מעט נמוך יותר של החלק המסומן. בשל צפוף אריזה של המטריצה ​​שלהם את קצב הזרימה בעמודות אלה הוא נמוכים וכתוצאה מכך בסיכון גבוה יותר של תאים ללא תווית כדי להיות לכוד בעמודה. עמודות LD לכן יש להשתמש רק לדלדול חמור של תת אוכלוסיות של תאים לא רצויות. סלקציה חיובית יכולה להתבצע על ידי תיוג מגנטי ישיר (נוגדן מצמיד microbeads) או עקיף (דגירה עם microbeads בעקבות incubation עם הנוגדן הראשוני). Microbeads מקים מסוים זמינים לסלקציה החיובית של תאים מסוגים רבים של תאים סרטניים ראשוניים כמו ערמונית או מלנומה ^27.

Protocol

המערך הכולל של הניסוי כולל הכנת תאים בודדים עיקריים מרקמת גידול, אפיון של תרבות התא העיקרי, דלדול פיברובלסטים ומיון תא המגנטי של CD133 + ו CD133 – תאים מלנומה מוצג באיור 1. 1. רכישת מדגם <li style=…

Representative Results

הכנה של תאים בודדים מרקמת גידול איור 2 מדגים גרורות ימפה resected של חולה מלנומה בשלב מאוחר לפני () ואחרי (ב ') לניתוק מכאני 2-4 חתיכות מ"מ. בעקבות ניתוק האנזימטית של הרקמה והסינון דרך רשת ניילון מיקרומטר 70, תאים היו pelleted וsupernat…

Discussion

על מנת להסיר זיהומים כדוריים אדומים מתא גלולת גידול מומלץ מאוד להשתמש בפתרון תמוגה תא הדם האדום מMiltenyi. היתרונות של lysing את אריתרוציטים מעל צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll המסורתית הם כי הוא מהיר יותר ופשוט יותר. יתר על כן, עם זיהומי Ficoll או תאי דם אדומים ואובדן של תאים סרטני?…

Materials

			Reagent
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Collagenase IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg	PAA Laboratories GmbH	H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
			Equipment
Cell strainer (70 μm)	BD Biosciences	352350
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
Natriumchloride	Merck KGaA	567440-1KG
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES)	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE