Patient Derived Cell Culture och isolering av CD133⁺ Förmodade Cancer stamceller från melanom

Summary

I den här artikeln beskriver framställningen av nyligen erhållna melanom vävnad i primära cellkulturer, och hur du tar bort föroreningar av erytrocyter och fibroblaster från tumörcellerna. Slutligen beskriver vi hur CD133⁺ Förmodade melanom stamceller sorteras från CD133^- Bulk med Magnetic cellsortering (MACS).

Abstract

Trots förbättrade behandlingar alternativ för melanom som finns idag, patienter med avancerat malignt melanom har fortfarande en dålig prognos för progressionsfri och total överlevnad. Därför måste translationell forskning för att ge ytterligare molekylära bevis för att förbättra riktade terapier för maligna melanom. Under de senaste, onkogena mekanismer relaterade till melanom var omfattande studerats i etablerade cellinjer. På vägen till mer personliga behandlingsregimer baserade på individuella genetiska profiler, föreslår vi att använda patientnära härledda cellinjer i stället för generiska cellinjer. Tillsammans med högkvalitativa kliniska data, speciellt om patienten uppföljning kommer dessa celler att bidra för att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom melanom progression.

Här rapporterar vi inrättandet av primära melanom kulturer från dissekerade färsk tumörvävnad. Detta förfarande innefattar hackning och dissociation av vävnad till enskilda celler, reborttagande av föroreningar med erytrocyter och fibroblaster samt primär kultur och tillförlitlig kontroll av cellernas melanom ursprung.

Färska rapporter visar att melanom, liksom majoriteten av tumörer, hamn en liten subpopulation av cancer stamceller (CSCs), som verkar uteslutande bränsle tumör initiering och progression mot metastaserande staten. En av de viktigaste markörer för CSC identifiering och isolering i melanom är CD133. För att isolera CD133 ⁺ CSCs från primära melanom kulturer har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) proceduren från Miltenyi resulterar i hög sortering renhet och livskraft CD133 ⁺ CSCs och CD133 ^– bulk, som kan odlas och funktionellt analyseras därefter.

Introduction

Kutana maligna melanom är den minst vanliga, men mest dödliga typen av hudcancer. På grund av en ökande förekomst, en hög grad av malignitet och en snabb spridning, melanom står nu för 75% av maligna hudtumörer dödsfall ^1,2. Förutom kirurgisk excision av primärtumör, kemoterapi, strålbehandling, immunterapi och kombinerad kemo-och immunoterapi av metastaserad melanom är state-of-the-art strategier för melanom behandling ^3,4. Dock malignt melanom kännetecknas av en dåligt svar på kemoterapeutika (5-12%) ^5,6, och endast de 50-70% av melanompatienter bär BRAF V600E nytta genmutation från lovande nya målinriktade behandlingar som behandling med vemurafenib ⁷ till förbättra total överlevnad, är en mycket bättre förståelse för mekanismerna bakom melanom tumörbildning behövs.

Att studera dessa mekanismer i det förflutna, väletablerade kommersiellaciellt tillgängliga cellinjer användes. Nyare metoder för att studera de molekylära händelser cancer initiering och progression använder primära kulturer härledda direkt från tumörvävnad – en strategi bär mångahanda förmåner: Forskaren har full kontroll över patient och vävnad urval. De samplade cellerna fått från sakkunnigt utvalda tumörvävnad, liknar tumören med alla dess heterogenitet och uppföljning data för patienten och en detaljerad patologi är tillgänglig för att egenskaperna hos kulturen att jämföras med de ursprungliga tumören ^8.

Däremot är användningen av etablerade cellinjer som relevanta modellsystem i cancerforskningen diskuteras kontroversiellt. Redan i 1987 Osborne och kollegor beskrivs signifikanta biologiska skillnader mellan MCF-7 humana bröstcancercellinjer från olika laboratorier ^9. Denna omfattande genomisk instabilitet och variation i RNA uttryck under subkultur var confirmed av Hiorns et al., och som stödjande data för bevis för att cellinjer inte utvecklas i kulturen, och därigenom försvaga direkt relevans för sådana etablerade kulturer som modeller för cancer hos människor ^10.

En annan viktig faktor, som till stor del har ignorerats under åren, är risken för kontaminering eller överväxt av kulturer med obesläktade "falska" celler, som först markerade över 20 år sedan genom att visa att ett stort antal cellinjer förorenade av HeLa celler ^8,11. Den feltolkning av data från "falska" cellinjer har nyligen framkommit i litteraturen igen. Med en kombination av DNA-profilering och molekylära cytogenetik, avslöjade MacLeod et al. Som 252 nya tumörhärledda humana cellinjer deponerade vid det tyska samlingen av mikroorganismer och cellkulturer (DSMZ), nästan 18% befanns vara inom arten eller mellan arter kors -föroreningar ^12,13.

För att undvika dessa problem och att använda sig av de fördelar som nämns ovan, beslutade vi att etablera låg passage melanomcellinjer från nyligen utskurna metastaser.

Robusta cell separation och analys teknik kräver encelliga preparat som skall genereras samtidigt begränsar celldöd och förstörelse av karakteristiska ytproteiner. En bänk instrument för automatiserad dissociation av vävnader i encelliga suspensioner är gentleMACS dissociator tillverkas av Miltenyi. Vid användning i kombination med C-gentleMACS Rör och optimerad dissociation lösningar, en effektiv och skonsam dissociation av tumörvävnad i ett slutet system uppnås samtidigt antigenepitoper och minska cellförlust. Instrumentet erbjuder optimerad, förinställda program för olika specifika tillämpningar och garantier standardiserade beredning av encelliga suspensioner från melanom vävnad ^14.

<p class = "jove_content"> Nya rapporter visade att majoriteten av tumörer hyser en liten subpopulation av så kallade cancer stamceller (CSCs), som enbart uppvisar tumör-initiera och självförnyande förmåga. Identifieringen av melanocyt-producerande stamceller i dermis av huden ledde till hypotesen att dessa celler kan vara ursprunget av cancer stamceller (CSCs) i melanom, eftersom exponering för UVA-strålning kan prima dessa celler för malign transformation ^15. Resultatet av en sådan genetisk lesion skulle vara celler som hyser en kombination av tumör och stamceller egenskaper cell.

En av de viktigaste markörerna föreslås att representera subpopulationen av CSCs i melanom är CD133 ^16-20. CD133 (även känd som Prominin 1), en medlem av Pentaspan transmembrana glykoproteiner, uttrycks i hematopoetiska stamceller, endoteliala progenitorceller, neuronala och glia stamceller ^21-23. Uttryck av CD133 är korrelerad medasymmetrisk celldelning ^24, och den glykosylerade epitopen av CD133 visades vara nedreglerade vid celldifferentiering ^25. Nyligen har CD133 ⁺ melanomceller visat sig ha självförnyelse och tumör-initiering kapacitet ^19,20.

För att studera funktionen av CD133 ⁺ förmodad melanom CSCs har vi modifierat och optimerat Magnetic cellsortering (MACS) system från Miltenyi Biotech att få höganrikat och livskraftiga populationer av CD133 ⁺ och CD133 ^– celler.

Magnetisk pärla-baserad cellseparation möjliggör antingen negativ selektion såsom visas av Matheu et al. ²⁶ eller positiv selektion som vi visar här. Under positiv selektion den särskilda mål-celltyp, t.ex. CD133-uttryckande celler, är magnetiskt märkta med mikrokulor, 50-nm superparamagnetiska partiklar som är konjugerade till mycket specifika antikroppar mot ettsärskilt cellytantigen. Under separering är de magnetiskt märkta cellerna kvarhålles i kolonnen i det magnetiska fältet i separatorn, medan omärkta celler strömma genom. Efter tvättningssteg, är kolonnen avlägsnas från det magnetiska fältet i separatorn, och målcellerna elueras från kolonnen. LS eller MS kolonner används under positivt val resulterar i fraktioner av märkta och omärkta celler med hög renhet. Å andra sidan, LD kolonner, som används för negativ selektion, resulterar i en något lägre renhet av den märkta fraktionen. På grund av tätare packning av sin matris flödeshastigheten i dessa kolumner är lägre resulterande i en högre risk för omärkta celler som skall fångas i kolumnen. LD kolumner bör därför endast användas för strikt utarmning av en oönskad cell subpopulation. Positiv selektion kan utföras genom direkt (antikropp kopplad till mikrokulor) eller indirekt magnetisk märkning (inkubation med mikrokulor efter incubation med den primära antikroppen). Specifika MACS mikropärlor är tillgängliga för positiv selektion av många celltyper av primära tumörceller som prostata eller melanom ^27.

Protocol

Den övergripande planen för försöket med angivande utarbetandet av primära singel-celler från tumörvävnad, karakterisering av primära cellkulturer, fibroblast utarmning och magnetiska cellsortering av CD133 + och CD133 – melanomceller visas i figur 1. 1. Prov Förvärv Kontrollera om etiskt godkännande innan man överväger nästa steg. Förbered en 50 ml tub med steril PBS kompletterad med 1% penicillin-streptomycin slutl…

Representative Results

Beredning av single-celler från tumörvävnad Figur 2 exemplifierar en resekerade metastas lymfkörteln ett sent skede melanompatient före (A) och efter (B) mekanisk dissociation i 2-4 mm bitar. Efter enzymatisk dissociation av vävnad och filtrering genom en 70 | im nylonnät, var cellerna pelleterades och supernatanten kastades. Vid detta steg vi observerade en hög förorening med erytrocyter såsom anges av den rödaktiga färgen på cellpelleten i figur 2C.</stro…

Discussion

För att ta bort erytrocyter föroreningar från tumören cellpelleten rekommenderar vi använder röda blodkroppar lys från Miltenyi. Fördelarna med lysera erytrocyter över den traditionella Ficoll densitetsgradientcentrifugering är att det är snabbare och enklare. Vidare föroreningar med Ficoll eller röda blodkroppar och förlust av tumörceller undvikas. När du observerar tillväxten av fibroblaster i den primära cellkulturen de bör tas bort omedelbart eftersom de normalt växa över tumörcellerna när de …

Materials

			Reagent
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Amphotericin B solution 250 μg/mL in deionized water	Sigma-Aldrich, Inc.	A2942-50ml
anti-fibroblasts microbeads	Miltenyi Biotec GmbH	130-050-601
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	130-092-395
Collagenase IV	Sigma-Aldrich, Inc.	C5138
DNase I	Applichem GmbH	A3778.0050
D-PBS without Ca, Mg	PAA Laboratories GmbH	H15-002
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
FBS Superior	Biochrom	S0615
Indirect CD133 Micro-Bead Kit human	Miltenyi Biotec GmbH	130-091-895	Includes: CD133/1(AC133)-Biotin, anti-Biotin MicroBeads and FcR Blocking Reagent
Penicillin-Streptomycin, liquid (100x)	Invitrogen GmbH	15140-122
Quantum 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Red Blood Cell Lysis Solution (10x)	Miltenyi Biotec GmbH	130-094-183
			Equipment
Cell strainer (70 μm)	BD Biosciences	352350
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-237
gentleMACS dissociator	Miltenyi Biotec GmbH	130-093-235
MACS Separator Multi Stand	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-303
MACS Seperation Columns 25 LS Columns	Miltenyi Biotec GmbH	130-042-401
MACSmix Tube Rotator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-753
Natriumchloride	Merck KGaA	567440-1KG
Pre-Separation Filters	Miltenyi Biotec GmbH	130-041-407
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec GmbH	130-090-976
Rotilabo-syringe filters (0.22 μm, PES)	Carl Roth GmbH & Co. KG	P668.1
Steritop-GP Filter Unit 500 ml	Miltenyi Biotec GmbH	SCGPS05RE