使用反时相蛋白的阵列（RPPA）探索在个人的肾细胞癌蛋白表达的变化
Summary
RPPA支持数百个样品，印在硝酸纤维素幻灯片同时进行审讯，用荧光标记的抗体蛋白的表达。这项技术已被应用在肾透明细胞癌的药物治疗的非均质性研究的效果。
Abstract
目前还没有治愈的疾病治疗的转移性肾透明细胞癌，最常见的变种。这种治疗性的一个关键因素被认为是分子复杂性的疾病1。如酪氨酸激酶抑制剂（TKI），舒尼替尼靶向治疗已被使用，但只有40％的病人会响应，这些患者绝大多数复发1年以内2。因此在肾细胞癌患者的内在和获得性耐药的问题是高度相关的。
为了研究抗酪氨酸激酶抑制剂，制定有效的个性化治疗的最终目标，有针对性的治疗后，在规定的顺序组织是必需的，已被证明是成功的做法，在慢性粒细胞白血病4。然而，这样的策略在肾细胞癌的应用是复杂的，高层次的b超视距间和肿瘤的异质性，这是一个功能的肾细胞癌5,6以及其他实体瘤7。即使在建立类似的介绍，肿瘤的分期，分级的患者Intertumoral异质性由于转录和遗传差异的。此外，它是明确的，也有很大的形态（肿瘤内）的异质性RCC，这很可能代表更大的分子异质性。 RCC肿瘤的综合形态分析和Fuhrman分级详细的映射和分类，用户可以通过选择有代表性的地区蛋白质组学分析。
基于蛋白质的分析的RCC 8是有吸引力的，但由于其广泛的可用性，在病理实验室，它的应用可以是有问题的，因为供应量有限，特异性抗体9。由于斑点印迹性质的反相蛋白质阵列（RPPA），抗体的特异性必须Ë预先验证的，使用的抗体，这种严格的质量控制是非常重要的。尽管这一局限斑点印迹格式不允许检测的小型化，使数百个样品用于印刷到一个单一的硝酸纤维素滑动。然后，印刷幻灯片可以用类似的方式进行分析，Western印迹分析与特定目标初级抗体和荧光标记的第二抗体的使用，允许复用。在所有的样品在幻灯片上的差异蛋白质表达，然后可以同时分析在一个更具成本效益和高通量的方式进行比较的相对水平的荧光。
Protocol
Representative Results
Discussion
RPPA这里介绍的方法代表一个高吞吐量的替代广泛使用，但相对较低的吞吐量的蛋白质分析的免疫印迹技术。该方法允许数百个样品是半定量的分析和比较，同时允许在很宽的选择的细胞系和组织样品中的关键蛋白的直接比较。复用与不同的抗体物种进一步增加电源的技术允许同时使用多种抗体。这里介绍的例子强调的能力RPPA在研究肿瘤的异质性和异质性靶向治疗的效果。
?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者FCO，DF，JN，DJH和GDS的工作上面提到的由由英国癌症研究中心实验癌症医学中心的首席科学家办公室，项目编号：ETM37和支持。 AL的工作是由皇家爱丁堡外科的护理和治疗癌症和医学研究理事会罗伯逊信托，梅尔维尔信托。 IO的支持，玛丽·居里行动和英国医学研究理事会共同资助的英国皇家学会的爱丁堡苏格兰政府奖学金。作者想感谢SCOTRRCC共同申请人及其合作者提出了有用的讨论本文讨论的主题。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
References
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
