ניתוח מחזור תא חי של<em> דרוזופילה</em> רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם
Summary
פרוטוקול לניתוח של מחזור תא חי<em> דרוזופילה</em> רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן מתוארת. פרוטוקול זה בו זמנית מספק מידע על גודל תא יחסי, מספר תא, ה-DNA ותוכן סוג התא דרך שושלת התחקות או ביטוי רקמות ספציפי של חלבוני ניאון<em> In vivo</em>.
Abstract
cytometry הזרימה כבר בשימוש נרחב כדי להשיג מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים, כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים. טכניקה זו הורחבה בהצלחה לרקמות mitotic של מודל אורגניזם תסיסנית למחקרים גנטיים של ויסות מחזור תא בגוף חי. בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי ומניפולציות גנטיות, ניתן לקבל מידע מפורט על השפעות על מספר תאים, גודל תא ומחזור תא הדרגת in vivo. עם זאת שיטה לחיות תאים זו הסתמכה על השימוש בצבע התא חדיר Hoechst 33342-DNA intercalating, הגבלת משתמשי cytometers זרימה המצוידים בלייזר UV. יש לנו שונה בפרוטוקול זה כדי להשתמש בצבע חדש יותר לחיות תאי ה-DNA, ויולט DyeCycle Vybrant, תואם עם לייזר 405nm הסגול הנפוץ יותר. הפרוטוקול המובא כאן מאפשר ניתוח מחזור תא יעיל בשילוב עם תאסוג, גודלו היחסי של תאים ומידע מספר תא, במגוון רחב של רקמות תסיסנית. פרוטוקול זה מרחיב את הטכניקה שימושית במחזור תא הניתוח לרקמות תסיסנית למנתח benchtop קטן, Cytometer ההתמקדות אקוסטית לכוונן, אשר ניתן להפעיל ומתוחזק בקנה מידת מעבדה אחת.
Introduction
cytometry הזרימה יכול לשמש למדידות של כדאיות תא, גודל תא יחסי, תוכן ה-DNA וביטוי חלבון פלואורסצנטי באוכלוסיות תאים חיים. עקב השכפול של ה-DNA הגרעיני במהלך השלב-S, מידע על תוכן ה-DNA באוכלוסייה של תאים יכולים לשמש כדי להסיק אחוזים יחסית בשלבי מחזור תא שונים 1-3. שיטה זו הפכה לאבן פינה של ניתוח מחזור תא במערכות מודל משמרים ליונקים.
זבוב פירות תסיסנית הפכה מערכת מודל מצוינת לניתוחים גנטיים בvivo של ויסות מחזור תא. הכלים הגנטיים הנרחבים הזמינים בזבובים לאפשר למניפולציות רקמה אלגנטית ספציפיות ומוסדרות באופן זמני של רגולטורים מחזור תא יחד עם בשושלת מבוססת חלבון פלואורסצנטי vivo התחקות 4-6. cytometry הזרימה נעשה שימוש כדי ללמוד תוכן ה-DNA במספר סוגי תאים תסיסנית, כולל endoreplicating תאים ותאים בתרבית mitotic 7,8. מקדמה חשובה במחקרי vivo מחזור התא נעשתה על ידי דה לה קרוז ואדגר, עם הפיתוח של פרוטוקול לניתוח תזרים cytometric של חיות דיפלואידים תסיסנית דיסקים דמותי 9,10, פרוטוקול בו נעשה שימוש והותאם על ידי מעבדות רבות. טכניקה זו, כאשר בשילוב עם גנטי בשושלת vivo מעקב דרך ביטוי חלבון פלואורסצנטי מושרה וסימון רקמות ספציפי, מאפשרת לאדם לקבל מידע על השפעות המניפולציה גנטיות בזמן הכפלת תא כללי, גודל תא ולקבוע את עיתוי מדויק של שלבי מחזור תא in vivo 9 , 11. אולם שיטה זו הסתמכה עד כה על השימוש בצבע תא ה-DNA intercalating החדיר Hoechst 33342 להכתים ולכמת-DNA בתאים חיים, שהגביל את המשתמשים לזרום cytometers עם לייזר UV מסוגל המרגש לצבוע Hoechst. אלה נמצאים בדרך כלל רק בממיינים (כלומר BD FACS VantaGE, BD FACSAria) או יקרות ססגוניות benchtop מערכות (כלומר BD LSR), תמיכה בדרך כלל המחייב ידי מתקני גרעין זרימה מוסדיים.
יש לנו שונה בפרוטוקול מבוסס Hoechst להשתמש לצבוע DNA לחיות תאים חדשים מInvitrogen, Vybrant DyeCycle יולט. צבע זה תואם לייזר ננומטר 405 סגול, נפוץ יותר בנתחים קטנים יותר המעבדתיים וזמין במנתח benchtop עצמאי הקטן, אקוסטית לכוונן התמקדות Cytometer. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח מחזור תא שיכול להיות בשילוב עם סוג התא, גודל תא, מספר תאים וניתוח שושלת במגוון רחב של רקמות דרוזופילה במהלך שלבים שונים של פיתוח באמצעות יולט DyeCycle ולכוונן. פרוטוקול זה מרחיב את מספר cytometers המתאים לניתוח כזה עם רקמות תסיסנית ומספק דוגמאות כיצד ניתן לשנות סוג של ניתוח מחזור תא חי זה לסוגי רקמות נוספים ושלבי התפתחות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ניתוח של מחזור התא, גודל תא יחסי ומספר תא היחסי ברקמות חיים תסיסנית בשלבי התפתחות שונים. כאשר ניתוח זה הוא בשילוב עם ביטוי תא מסוג מסוים חלבון פלואורסצנטי או שושלת התחקות, ניתן לקבל מידע מפורט על תגובות הסלולר מחזור תא דיסקרטי או הפרעו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאאידה דה לה קרוז לפיתוח והוראת הפרוטוקול המקורי לגרסה זו מבוססת 10. לעבוד במעבדה Buttitta נתמך על ידי מענק NIH GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
References
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
