마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리
Summary
태아 얼굴 외배엽과 mesenchyme의 분리를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 먼저 전체 배아를 취급하는 전체 얼굴 프로미넌스 prominences을 해부하기 위해 Dispase II를 사용하고 얼굴 외배엽과 mesenchyme 구분합니다.
Abstract
Orofacial 갈라진 틈은 1,000 신생아 세계 1,2에서 1.5에 영향을 미치는 가장 자주 craniofacial 결함입니다. Orofacial clefting는 이상 얼굴의 개발 3로 인해 발생합니다. 얼굴의 인간과 마우스, 초기 성장 및 패턴에서 조직의 몇몇 작은 꽃 봉오리, 4,5 얼굴 프로미넌스 prominences에 의존하고 있습니다. 이점 정면 코 프로세스 (FNP), 턱의 프로미넌스 prominences (MxP)와 mandibular의 프로미넌스 prominences (MDP) : 얼굴은 여섯 가지 주요 프로미넌스 prominences에서 파생됩니다. 이러한 프로미넌스 prominences는 놓인 상피으로 쌌다 아르 mesenchyme의 swellings로 구성되어 있습니다. 여러 종의 연구는 얼굴 외배엽과 mesenchyme 사이의 누화 신호를하면 얼굴 6 형성에 중요합니다 것으로 나타났습니다. 그러나,이 신호를 릴레이에 참여 유전자에 관한 기계론의 내용은 부족합니다. 하나의 유전자 표현의 포괄적 인 이해를 얻을 수있는 방법 구속력이 전사 인자 및 develo과 관련된 염색질 마크핑 얼굴 외배엽과 mesenchyme은 분리 조직 구획을 분리하고 특성화하는 것입니다.
여기 배아 일 (E) 10.5 프로미넌스 prominences의 융합을 앞에 마우스 얼굴 형성에 중요한 발달 단계에서 얼굴 외배엽과 mesenchyme를 분리하기위한 방법을 제시한다. 우리의 방법은 우리가 이전에 얼굴 프로미넌스 prominences에게 7 해부에 사용했던 방법에서 구성된다. 이 이전 연구에서 우리는 근친 C57BL을 고용 한 /이 변형 등 6 마우스 유전학, 유전체학 및 얼굴 형태 8에 대한 표준이되었습니다. 여기하지만 가능한 조직의 더 한정된 수량으로 인해, 우리는 축산에 대해보다 강력한를 구입 저렴 outbred CD-1 변형을 활용, 모든 근친보다 쓰레기 당 더 많은 배아 (12-18)를 생산 돌봐 있습니다 마우스 변형 8. 배아 분리 후, 중성 단백 분해 효소 Dispase II는 전체 배아을 치료하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 얼굴 프로미넌스 prominences가 해부했다에드 아웃, 그리고 얼굴 외배엽은 mesenchyme에서 분리되었다. 이 방법은 얼굴 외배엽과 mesenchyme 모두 그대로 유지합니다. 이 방법을 사용하여 얻은 샘플은 단백질 감지, 염색질 immunoprecipitation (칩) 분석, microarray 연구 및 RNA-seq 등의 기술을 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 초기 Dispase II 치료 단계에 따라 배아 마우스 얼굴 외배엽과 mesenchyme을 분리 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 이전 연구에서, 우리는 이전 Dispase II 치료에 얼굴 프로미넌스 prominences의 절개를 수행했지만, 우리는 지속적으로 mesenchyme는 "끈적"과 조작이 더 어려워지고있는 것으로 나타났습니다. 새로운 프로토콜은이 문제를 방지합니다. 조합 Dispase II 아래로 pipetting과…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그림 1과 도움과 토론 연구소의 다른 회원 배아 헤드를 도시에 아이린 최 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 DE012728 (TW)에 의해 지원됩니다
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
References
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Biologie du développement. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Biologie du développement. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
