מודלים עכבר לטרשת עורקים שתל
Summary
אנו מתארים פרוטוקולים לarteriosclerois שוחדנו העכבר (GA) דגמים אשר כרוך חציצה של מגזר כלי עכבר לנמען של אותו הזן המולד. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, המודל יכול להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על GA.
Abstract
arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של כלי דם שתל העץ כולו. המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הוא ההתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה. כאשר קטע עורק הכלילי אנושי התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient, את intimas אפשר היה להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T האנושיים אלוגנאית לתורם העורק או אקסוגני אנושי IFN-γ בהיעדר תאי T אנושיים. התערבותם של אב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר היא מוגבלת כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת הדחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטלת לחלוטין את כל תורמים שמקורם בתאי הדם מהשתל בתוך שניים השלוש שבועות. לאחרונה פיתחנו שניים מ 'חדשouse דגמים לעקוף את הבעיות הללו. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). דחיית שתל במקרה זה מופנה רק נגד אנטיגנים histocompatibility קלים המקודדים על ידי כרומוזום Y (בהווה בזכר אך לא נקבה) ותגובת הדחייה שמתפתחת הוא עצל במידה מספקת כדי לשמר הנגזרות תורמות תאי שריר חלק למשך מספר שבועות. המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את הקולטן לIFN-γ ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של העכבר כבד עם וקטור adenoviral. אין דחייה במקרה זה כמו גם תורם ועכברי נמען הם מאותו הזן והמין, אך תאי שריר חלק תורם להתרבות בתגובה לציטוקינים ואילו מארח שמקורם בתאים, חסרי קולטן לציטוקין זה, לא מגיב. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, ניתן להשתמש בשני המודלים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על התקדמות GA. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לדגמי GA העכבר שלנו.
Introduction
arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של עץ כלי דם השתל כל 7. בשלבים מוקדמים עלולים לגרום להיצרויות אקסצנטרית ומוקדים כי הם ברורים יותר בעורקים, ובכך דומה יותר מקרוב היצרויות ראתה בטרשת עורקת קונבנציונלית. אובדן לומן של התוצאות מהתרחבות כלי שתל intimal עקב חדירה של תאי T ומקרופגים מארחים ובמיוחד להצטברות של מטריקס ודמוי תאי שריר חלק שמקורו משתל, מארח או שניהם 5, 13, 19, כי הוא יפוצה כראוי על ידי שיפוץ כלי החוצה. בallografts לב, הנגעים המשמעותיים ביותר מהבחינה קלינית הם אלה בעורקים הכליליים וepicardial intramyocardial. סופו של דבר, GA של העורקים הכליליים יגרום אי ספיקת לב איסכמית. GA הוא הגורם העיקרי לגר לב מאוחרהפסד מאחור. ביצרויות של GA לעצור בקווי התפר, חזק להפליל את תגובת המארח לalloantigens שתל בפתוגנזה שלה ומוביל אותנו לסווג GA כסוג של דחייה כרונית 3. עם זאת, צורות אחרות של פגיעה בעורקים עלולות להגביר את הסיכון של GA, בין אם באמצעות הגדלת נטל הנקי של פציעה או על ידי העמקת ו / או ויסות תגובת alloimmune. התא רירית (EC) האנדותל של עורקי שתל נשמר בGA האנושי והאזורים השטחיים ביותר של אינטימה בסמוך לרירית EC הוא האתר הסתנן ביותר בכבדות על ידי מארח נגזר IFN-γ-ייצור תאי T ומקרופגים 11; ב חלק מהחולים GA קשור עם ההתפתחות של alloantibodies תורם ספציפי אשר נקלטות על ידי EC שתל 16 אך הכלים להראות מעט עדויות של נמק fibrinoid שאופייני לדחיית נוגדן בתיווך 11 חריפה.
המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הואהתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה, אם ניתן לעצור את התהליך הזה, GA סביר להתקדם. עבודות קודמת מהקבוצה שלנו הראו כי intimas של מגזרי עורקים הכליליים אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T אנושי אלוגניות לתורם העורק ושתהליך זה יכול להיות מעוכב על ידי נטרול האנושי IFN- γ 18. IFN-γ האנושי יתר אקסוגני עלול לגרום intimal (והמדיאלי) תא שריר חלק (VSMC) ריבוי כלי דם בשתלים עורקיים אלה בהיעדר תאי T האנושי 15, 17. (חשוב לציין כי אדם ועכבר IFN-γ לא חוצה מינים, פוסלי השפעות עקיפות על מארח העכבר במערכת הניסיונית הזה.) יש מודלים עכבריים אלו טובת משחזר תא T / אינטראקציות תא כלי דם אנושיים וintimal נגעים מורכבים במידה רבה של תאי אדם (כלומר שתל המופק),כפי שכבר ציין בדגימות קליניות, אבל הם לא לסכם את המצב הקליני באופן מלא משום שהם מתעלמים מתפקידו של מקרופאגים המארחים ואולי גם סוגי תאים אחרים מעורבים בנגעי השתלות קליניים. מודל עכבר רגיל של תהליך זה באופן תיאורטי יכול לטפל בבעיה זו, המשלימה את המגבלות של המודל האנושי על ידי מעורב מערכת חיסונית מארח שלמה ומתן יתרון נוסף המאפשר את כוחו של עכבר גנטי גישות שיחולו על GA. שני המודלים העכבר הנפוץ ביותר כרוכים בהשתלת לב ועורקי heterotopic orthotopic 1 השתלה. הנגעים המתפתחים בעורקים של לב heterotopic שתלים עשויים במידה רבה של תאים מארחים, העשויים ממוצא מח עצם, ואילו תאי intimal של העורקים בלב אדם שתלי הם בעיקר ממוצא שתל 5, 13, 19. זוהי הבחנה משמעותית שהובילה אותנו לפתח מודלים עכבר חלופיים. התערבותם שלאב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר הוא עוד יותר מוגבל כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת דחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטל לחלוטין את כל תאי כלי הדם תורם הנגזרים מאת השתל בתוך שניים השלוש שבועות 19. כתוצאה מכך, השינויים שלאחר מכן ראו במגזר הכלי התערב הם אך ורק תגובה של תאי מארח שאכלסו מחדש את decellularized כלי הפיגום, יוצרת מצב artifactual ביותר של שייכות מוגבלת כמודל לשינויים בכלי שתל המתרחשים במרפאת. לאחרונה פיתחנו שני מודלים עכבר חדשים כדי לעקוף את הבעיות האלה 21. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את receptor לIFN-γ (IFN-γR-KO) ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של כבד העכבר עם וקטור adenoviral. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים ואת היתרונות של דגמי GA העכבר שלנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו מתמקדים בדגמי GA עכבר. ניתן ליישם את הנהלים לדגמי השתלת שתל אחרים. מודלים אלה כוללים xenograft האנושי (מקטעי עורקים הכליליים כלומר אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient), ודגם GA עכבר דחייה חריף (כלומר אב העורקים עכבר מזן גנטי אחד לנמען א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R01 HL109420 לWM וAHA 9320033N לLY.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N. Allograft arteriopathy: pathogenesis update. Cardiovasc. Pathol. 13, 33-40 (2004).
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis – Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circ. Res. 100, 622-632 (2007).
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
