Summary
نحن تصف بروتوكولات لدينا arteriosclerois الكسب غير المشروع الماوس (GA) نماذج التي تنطوي على مداخلة من شريحة سفينة الماوس إلى المتلقي من نفس السلالة الفطرية. بواسطة backcrossing بتغيرات جينية إضافية إلى الجهة المانحة السفينة، يمكن للنموذج تقييم تأثير جينات معينة على GA.
Abstract
arteriosclerois الكسب غير المشروع (GA)، وتسمى أيضا اعتلال وعائي طعم خيفي، هي آفة مرضية أن يتطور مع مرور أشهر إلى سنوات في الأعضاء المزروعة التي تتميز منتشر، تضيق كفافي من شجرة الأوعية الدموية الكسب غير المشروع بأكمله. العنصر الأكثر أهمية من GA المرضية هو انتشار السلس خلايا تشبه العضلات داخل البطانية. عندما يتم موسط شريحة الشريان التاجي الإنسان في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي، وintimas يمكن توسيع ردا على خلايا T الإنسان نقل adoptively خيفي إلى الجهة المانحة الشريان أو خارجية الإنسان الإنترفيرون γ في غياب الخلايا التائية البشرية. مداخلة من الشريان الأورطي الفار من سلالة واحدة إلى أخرى المستلم سلالة الماوس يقتصر كنموذج لهذا الرفض المزمن في البشر لأن استجابة الرفض الخلية بوساطة الحادة في هذا النموذج الماوس يلغي تماما كل الخلايا المانحة المستمدة من الأوعية الدموية من الكسب غير المشروع في غضون شهرين الى ثلاثة أسابيع. وقد وضعنا مؤخرا اثنين متر جديدة[أوس] نماذج للتحايل على هذه المشاكل. النموذج الأول ينطوي على مداخلة من شريحة سفينة من ماوس الذكور إلى مستلم الإناث من نفس السلالة الفطرية (C57BL/6J). يتم توجيه رفض الكسب غير المشروع في هذه الحالة فقط ضد مستضدات التوافق النسيجي طفيفة المشفرة بواسطة كروموسوم Y (موجودة في الذكور ولكن ليس الأنثى) واستجابة الرفض الذي تستتبعه هو كسلان بما فيه الكفاية للحفاظ على خلايا العضلات الملساء المانحة المستمدة لعدة أسابيع. النموذج الثاني ينطوي فاصلة شريحة الشريان من النوع البري C57BL/6J المانحة الماوس إلى ماوس المضيف من نفس السلالة والجنس التي تفتقر إلى مستقبلات للالإنترفيرون γ تليها إدارة الماوس الإنترفيرون γ (تسليمها عن طريق العدوى من الفأرة الكبد مع متجه الفيروسة الغدانية، وليس هناك رفض في هذه الحالة لأن كلا من الجهات المانحة والمتلقية الفئران هي من نفس السلالة والجنس ولكن الخلايا المانحة العضلات الملساء تتكاثر ردا على خلوى في حين أن الخلايا المشتقة من المضيف، وتفتقر إلى مستقبلات للهذا خلوى، لا تستجيب. بواسطة backcrossing بتغيرات جينية إضافية إلى الجهة المانحة السفينة، كلا النموذجين يمكن استخدامها لتقييم تأثير جينات معينة على GA التقدم. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة لدينا الماوس GA النماذج.
Introduction
arteriosclerois الكسب غير المشروع (GA)، وتسمى أيضا اعتلال وعائي طعم خيفي، هي آفة مرضية أن يتطور مع مرور أشهر إلى سنوات في الأعضاء المزروعة التي تتميز منتشر، تضيق كفافي من كامل شجرة الأوعية الدموية الكسب غير المشروع 7. قد يسبب المراحل المبكرة التضيق غريب الأطوار والتنسيق التي هي أكثر وضوحا في الشرايين، وبالتالي تشبه على نحو أوثق التضيق ينظر في تصلب الشرايين التقليدية. فقدان التجويف السفن الكسب غير المشروع نتائج من التوسع باطنة بسبب تسلل الخلايا T المضيفة والضامة وخصوصا لتراكم المصفوفة خارج الخلية والعضلات الملساء مثل الخلايا نشأت من الكسب غير المشروع، مضيف أو كليهما 5، 13، 19، أن يتم تعويض كاف بواسطة الخارج إعادة عرض السفينة. في المغايرة القلب، الآفات الأكثر أهمية هي تلك سريريا في الشرايين التاجية نخابي وداخل عضلة القلب. في نهاية المطاف، سوف GA الشرايين التاجية يسبب فشل القلب الإقفاري. GA هو السبب الرئيسي في وقت متأخر غرام القلبفقدان الخلف. والتضيق من GA تتوقف عند خطوط الدرز، تورط بقوة استجابة المضيف لalloantigens الكسب غير المشروع في المرضية ويقودنا لتصنيف GA باعتبارها شكلا من أشكال الرفض المزمن 3. ومع ذلك، قد غيرها من إصابة الشرايين أشكال تزيد من خطر GA، إما من خلال زيادة العبء صافي الإصابة أو عن طريق تكثيف و / أو تحوير استجابة منيع للمستضد الخيفي. يتم الاحتفاظ الخلية (EC) بطانة بطانة الشرايين الكسب غير المشروع في GA الإنسان والمناطق الأكثر سطحية من البطانية المتاخمة للبطانة EC هو موقع تسلل بشدة من المضيف المستمدة من الإنترفيرون γ إنتاج خلايا تي والضامة 11؛ في بعض المرضى يرتبط GA مع تطور alloantibodies المانحة الخاصة التي تربط لالكسب غير المشروع EC 16 ولكن الأوعية تظهر أدلة تذكر للنخر فيبرينية الذي هو سمة من الرفض الحاد الأجسام المضادة التي تتوسط فيها 11.
العنصر الأكثر أهمية من GA المرضية هوانتشار الخلايا على نحو سلس مثل العضلات داخل البطانية، وإذا كان يمكن القبض على هذه العملية، من غير المرجح أن تقدم GA. وكان العمل السابق من مجموعتنا أظهرت أن intimas من قطاعات الشريان التاجي الإنسان موسط في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي توسيع استجابة لخلايا نقل adoptively T الإنسان خيفي إلى الجهة المانحة الشريان وأن هذه العملية يمكن أن تحول دون تحييد الإنسان الإنترفيرون γ 18. الخارجية علاوة على ذلك الإنسان الإنترفيرون γ يمكن أن تسبب باطنة (وسطي) انتشار الخلايا العضلية الملساء (VSMC) الأوعية الدموية في هذه الطعوم الشريانية في غياب الخلايا التائية البشرية 15 و 17. (من المهم أن نلاحظ أن الإنسان والفأر الإنترفيرون γ لا يعبرون الأنواع، مستبعدا الآثار غير المباشرة على المضيف الماوس في هذا النظام التجريبي.) هذه نماذج الماوس أنسنة والاستفادة من تلخص الإنسان T خلية / التفاعلات الخلية الأوعية الدموية وباطنة وتتكون إلى حد كبير من الآفات الخلايا البشرية (أي الكسب غير المشروع المستمدة)،كما لوحظ في العينات السريرية، لكنها لا تلخص تماما الوضع السريري لأنها تتجاهل دور الضامة المضيف وأنواع الخلايا ربما الأخرى المشاركة في الآفات زرع السريرية. A نموذج الفأر التقليدية من هذه العملية يمكن أن تعالج هذه المشكلة نظريا، استكمال أوجه القصور في نموذج إنساني من خلال إشراك الجهاز المناعي المضيف كاملة وتوفير ميزة إضافية تتمثل في السماح للقوة النهج الوراثية الماوس ليتم تطبيقها على جورجيا. نماذج الماوس الأكثر استخداما على نطاق واسع اثنين تنطوي على زرع القلب والشريان منتبذ مثلي زرع 1. مصنوعة من الآفات التي تنمي في شرايين القلب ترقيع منتبذ إلى حد كبير من خلايا المضيف، على الأرجح من أصل نخاع العظام، في حين أن الخلايا البطانية في الشرايين في ترقيع قلب الإنسان هي في الغالب من أصل الكسب غير المشروع 5، 13، 19. هذا هو الفرق الكبير الذي أدى بنا إلى تطوير نماذج الماوس بديل. مداخلةوالشريان الأورطي الفار من سلالة واحدة إلى أخرى المستلم سلالة الفأر هو محدود حتى أكثر كنموذج لهذا الرفض المزمن في البشر لأن الخلية بوساطة الحاد استجابة الرفض في هذا النموذج الماوس يلغي تماما كل خلايا الأوعية الدموية المانحة المستمدة من الكسب غير المشروع في غضون شهرين الى ثلاثة 19 أسابيع. وبالتالي، فإن تغييرات لاحقة شهدت في قطاع سفينة موسط هي وحدها استجابة الخلايا المضيفة التي إسكانها في decellularized سفينة السقالة، وخلق حالة مصطنعة للغاية من أهمية محدودة كنموذج للتغيرات في الأوعية الكسب غير المشروع التي تحدث في العيادة. وقد وضعنا مؤخرا اثنين من نماذج الماوس الجديد للتحايل على هذه المشاكل 21. النموذج الأول ينطوي على مداخلة من شريحة سفينة من ماوس الذكور إلى مستلم الإناث من نفس السلالة الفطرية (C57BL/6J). النموذج الثاني ينطوي فاصلة شريحة الشريان من النوع البري C57BL/6J المانحة الماوس إلى ماوس المضيف من نفس السلالة والجنس التي تفتقر إلى تفصيلeptor لالإنترفيرون γ (الإنترفيرون γR-KO)، يليه إدارة الماوس الإنترفيرون γ (تسليمها عن طريق العدوى من كبد الفأر مع متجه الفيروسة الغدانية. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة ومزايا لدينا الماوس GA النماذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
طعم خيفي مسانج الماوس والكسب غير المشروع نموذج زرع
وقد وافق جميع الدراسات على الحيوانات من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان لجان استخدام جامعة ييل. لنموذج طعم خيفي، وموسط شرائح الأبهر الصدري من الذكور، 4-5 الاسبوع WT القديمة (C57BL/6J) أو الفئران الإنترفيرون γR-KO في الشريان الأورطي البطني من المتلقي أنثى، الأسبوع WT القديمة 8-12 باستخدام نهاية إلى نهاية المجهرية تقنية توصيلي (انظر المقبل للحصول على التفاصيل). للحصول على نموذج الكسب غير المشروع مسانج، وموسط شرائح للأبهر الصدري من الذكور، 4-5 الاسبوع الفئران WT القديم إلى أبهر البطن من الذكور، 8-12 أسبوع من العمر الإنترفيرون γR1-KO باستخدام نهاية إلى نهاية المجهرية توصيلي تقنية. في 1 أسبوع بعد العمل الجراحي، تم تلقيح الحيوانات الرابع مع Ad5.CMV الماوس الإنترفيرون γ أو Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) في 1 × 10 9 PFU. مصل الماوس الإنترفيرون γ تم قياس مستويات بواسطة ELISA (eBioscience) في 1 و بعد 5 أسابيع الإدارة اتش. بعض الحيوانات تلقى BrdU(سيغما الدريخ) في 100 ملغ / كغ الشوري لمدة 2 اسابيع قبل التضحية.
نهاية إلى نهاية المجهرية تقنية توصيلي (سيتم اتخاذ فيديو لهذا الجزء):
1. إجراء المانحة
- تخدير الفئران مع الحقن داخل الصفاق المانحة من الكيتامين (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
- بعد التأكد من التخدير كافية، ضع الفئران المانحة تحت المجهر التشغيل في X8-30 التكبير على صينية في موقف ضعيف، واستخدام اليود الوسادة الإعدادية والإعدادية الوسادة الكحول لإعداد جدار الصدر.
- شق جدار الصدر الأمامي من خلال الضلوع والحجاب الحاجز لفضح القلب.
- فتح الأذين الأيمن، وضخ 10 مل من heparinized (100 U / مل) محلول ملحي في البطين الأيسر لطرد الفئران باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة عيار 25.
- يقطع القلب والرئتين لفضح طول الشريان الأورطي الصدري.
- تشريح الشريان الأورطي الصدري بعناية لتقليل الصدمة مباشرة، حين إلىه تحديد وligate وتقسيم فروع الخشب باستخدام 11-0 خاط بالقرب من الشريان الأورطي.
- مرة واحدة في الشريان الأورطي الصدري خال من الأنسجة المحيطة بها، واستئصال الأبهر الصدري كامل للزرع.
- مسح نهاية قطع من الشريان الأورطي المانحة مع heparinized (100 U / مل) محلول ملحي، وتخزينها في نفس الحل على الجليد (حتى 6 ساعة) حتى الزرع.
2. إجراء المتلقي
- حقن الفئران المتلقي مع كيتوبروفين الملكية الفكرية (5 ملغ / كلغ) لتسكين الألم، وthenanesthetize الفئران مع الكيتامين IP (50 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ). الفئران المتلقية هي تخدير عميق في غضون 10 دقيقة لمدة 60-90 دقيقة. أثناء الجراحة، ويتم تقييم مستوى التخدير كل 15 دقيقة بواسطة معسر جدار البطن الأمامي أو القدم باستخدام ملقط. إذا يتفاعل الحيوان إلى المنبهات الضارة في أي وقت أثناء الجراحة، سيتم من قبل SC أو الدردشة تدار جرعة إضافية من الكيتامين وزيلازين (1/4 أو 1/3 جرعة الأصلي)
- بعد التأكد من التخدير كافية، يحلق الفراء في جدار البطن الأمامي باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية، وتنظيف الجلد باستخدام اليود الإعدادية الوسادة والكحول الاعداديه منصة، وتغطية العينين باستخدام مرهم للعين. أثناء الجراحة، سيتم استخدام تقنيات العقيم التالية للعمليات، بما في ذلك التنظيف طاولة العمليات مع التبييض 10٪، وارتداء قفازات معقمة وباستخدام أدوات معقمة المجهرية (الصكوك تعقيمها بالبخار لبدء العملية، ثم الزجاج الساخن حبة تعقيم الصكوك بين عمليات متعددة، الخ).
- وضع الفئران المتلقية تحت المجهر التشغيل في التكبير من X8-30 على صينية في موقف ضعيف.
- شق جدار البطن في خط الوسط من سيفي الشكل إلى العانة، وانتشرت جدار البطن بصرف النظر باستخدام الصغرى ضام لفضح تجويف البطن.
- سحب الأمعاء متفوق والتفاف بشاش مبلل بمحلول ملحي. الفئران المتلقية تصبح توترت بسبب فقدان هيئة التعليم العالير من خلال الأمعاء تخريجها. فمن المهم للحفاظ على الدفء الحيوان. ومع ذلك، لا يتم استخدام لوحة التدفئة أثناء الجراحة كما انخفاض حرارة الجسم متواضعة ذات فائدة في منع إصابة في العمود الفقري خلال انسداد تدفق الدم الأبهري وكذلك هناك نقل الحرارة غير فعالة مع تدفق الدم الغائب على النصف السفلي من الجسم الفئران.
- نقل الأعضاء التناسلية دون المستوى، والتفاف مناطق البطن من الفئران المتلقية بشاش المالحة حل مبلل، واستخدامها لسحب المستقيم إلى الجانب الأيمن من البطن. والمروية الأنسجة تتعرض دوريا مع محلول ملحي خلال الزرع.
- تشريح بصراحة جزء من الشريان الأورطي infrarenal بين السفينة الكلوي قريب والتشعب الأبهري بشكل أقصى وفصل من الوريد الأجوف السفلي (IVC) بعناية.
- تحديد وligate كل من الفروع الصغيرة التي تنشأ من هذا الجزء من الشريان الأورطي البطني باستخدام مادة البولي أميد 11-0 خياطة حيدة.
- عبر المشبك الجزء المعزول منالأبهر bdominal باستخدام اثنين من المشابك الأوعية الدموية المجاورة بشكل مباشر 5 مم وبصرف النظر، واحد في كل نهاية.
- القطع الشريان الأورطي البطني بين المشابك باستخدام الصغرى مقص حاد لإنشاء مواقع توصيلي.
- يقطع شريحة صغيرة من الشريان الأورطي البطني (تصل إلى 0.4 ملم في الطول) من واحد قطع الشريان الأورطي نهاية المتلقي مقطوع لاستيعاب الكسب غير المشروع الأبهر المانحة.
- مسح شرائح الأبهر بين المشابك باستخدام محلول ملحي heparinized لإزالة الدم المتبقي. يتم ري قطاعات الأبهر بين المشابك والكسب غير المشروع الأبهر المانحة دوريا مع heparinized (100 U / مل) محلول ملحي (ما يصل الى 40 مل / كجم) خلال مفاغرة.
- القطع جانبي الشريان الأورطي المانحة مع الدقيقة مقص حاد لإنشاء الكسب غير المشروع شريحة من 2.5 ملم في الطول للزرع.
- وضع الكسب غير المشروع الأبهر المانحة في موقف مثلي، يفاغر الدانية والقاصية نهاية الكسب غير المشروع المانحة لالدانية والقاصية قطع نهاية المستلم من الشريان الأورطي البطني، على التوالي، مع وضع حد-Tنمط O-نهاية باستخدام مادة البولي أميد 11-0 خياطة حيدة.
- لالغرز المستمر، ضع الغرز البقاء في 3 و 09:00 المواقف أولا. بين اثنين من الغرز البقاء في كل جانب من الكسب غير المشروع، يفاغر على حد سواء حواف قطع في غرز 3-4 باستخدام الخيوط الجراحية على التوالي، وربط الغرز تشغيل للبقاء الغرز مع عقدة مزدوجة. لأن كلا طبقات من إغلاق مستمرة، يتم زيادة خطر تفزر. يجب أن يكون الكسب غير المشروع الأبهر المانحة في طول المناسبة للاتصال الدانية والقاصية قطع نهاية المستلم من الشريان الأورطي البطني.
- لالغرز توقف، بناء أربعة مفاغرة في 3 و 09:00 المواقف في كلا الجانبين من الكسب غير المشروع أولا، ويفاغر على حد سواء حواف قطع في غرز 3-4 بين اثنين من الغرز البقاء في كل جانب من الكسب غير المشروع.
- الافراج عن المشبك البعيدة للسماح بتدفق الوراء في الكسب غير المشروع، وتحديد مواقع النزيف وجعل غرز إضافية في غضون 3 دقائق.
- بعد التأكد الارقاء مرضية، والإفراج عن المشبك الداني.
- تأكيد المباح الكسب غير المشروع من قبل وجود نبض قوي في الكسب غير المشروع والجزء المجاور القريب من الشريان الأورطي البطني الأم، وخاصة في الجزء المجاور القاصي من الشريان الأورطي البطني والشريان المساريقي السفلي. النظر في تخثر في مواقع توصيلي إذا كان نبض يقلل في غضون بضع دقائق بعد استعادة تدفق الدم.
- إرجاع الأمعاء إلى تجويف البطن.
- خياطة إغلاق جدار البطن باستخدام 5-0 خياطة النايلون في طبقة العضلات وطبقة الجلد، على التوالي.
- وضع الفئران المتلقي في قفص نظيفة على الجزء العلوي من وسادة التدفئة، والانتظار 1-2 الموارد البشرية لالفئران ليستعيد وعيه والتعافي من التخدير. فمن المهم للحفاظ على الدفء الكافي الحيوان خلال فترة الانتعاش. الحفاظ على الفئران في قفص دافئ وجاف قبل أعقاب الحيوان من التخدير.
- تقييم وظيفة الحركة من أطرافه الخلفية بعد الشفاء الفئران، ومرة أخرى في اليوم الثاني. وسوف يتم تأكيد عملية جراحية زرع ناجحة طو يتم احترام أي خلل في الأطراف الخلفية في الفئران المتلقية في اليوم الثاني.
- إدارة الفئران المتلقي مع كيتوبروفين في مياه الشرب (5 ملغ / كغ / د = 27 ميكروغرام / مل في مياه الشرب) لمدة 48 ساعة. إذا أي الفئران المتلقية تعاني من ألم غير مرتاح من المسكنات بعد العملية الجراحية كما يتضح من فقدان الحركة، وعدم العريس، غير طبيعية تتزاحم الموقف، وغيرها، وسوف يتم التخلص. وسوف يتم التخلص من الحيوانات في نهاية محددة سلفا نقاط بعد 1-60 أيام.
تحليل الكسب غير المشروع
وتم شراء ترقيع الشريان في طعم خيفي في 4 أسابيع والطعوم في نموذج الكسب غير المشروع مسانج كانت 6 أسابيع بعد العملية (بعد 5 أسابيع العدوى الفيروسية) وتحليلها بواسطة تقنيات النسيجية القياسية لالمرنة فان Gieson (EVG) تلطيخ، الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) تلطيخ وتلطيخ المناعي. تم التقاط الصور باستخدام نظام المجهر المناعي (زايس). كان العد الخلية نواة محاطة المناعية إيجابية أداءإد تحت التكبير عالية ومتوسط من 5 المقاطع العرضية لكل الكسب غير المشروع. القياسات منطقة الكسب غير المشروع من التجويف (داخل البطانة)، البطانية (بين الصفيحة المرنة البطانة والداخلية، IEL)، ووسائل الإعلام (بين IEL والصفيحة المرنة الخارجية، وثعبان البحر)، سمك الجدار (بين الصفيحة المرنة البطانة والخارجية) وحسبت السفينة كله (داخل ثعبان البحر) من 5 المسلسل المقاطع العرضية، 150 ميكرون وبصرف النظر عن كل الكسب غير المشروع، وذلك باستخدام تحليل الصور بمساعدة الحاسوب والمعاهد الوطنية للصحة الصورة 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
التحليل الإحصائي
يتم التعبير عن كافة البيانات كما يعني ± SEM. ثنائي الطرف، وأجريت الاختبارات ر الاقتران وتحليل ANOVA اتجاهين باستخدام برنامج حاسوبي بريزم (GraphPad البرمجيات). واعتبرت الاختلافات مع P <0.05 للإشارة إلى الأهمية الإحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الماوس طعم خيفي تصلب الشرايين (GA) نموذج: في هذا النموذج، يتم زرعها في الشريان الأورطي المانحة الذكور إلى الإناث المتلقية بحيث المضيف يدفع alloreactive T الردود منيع للمستضد الخيفي الخلية بوساطة ضد مستضد Y قاصر (القاصر التوافق النسيجي HY المستضد الخاص بالذكور) أعرب عن الكسب غير المشروع 12، وبدوره T الخلية المنتجة الإنترفيرون γ محركات VSMC انتشار 20 كما لوحظ في نماذج أخرى زرع طعم خيفي 2، 6، 8-10، 14. وموسط A جزء من الشريان الأورطي الصدري من ذكر المانحة جراحيا إلى الشريان الأورطي البطني من مستلم الإناث، وكانت تحصد aortas في 4 أسابيع بعد الزرع (الشكل 1A). تم إجراء التحليل النسيجي للترقيع الشريان بواسطة المرنة فان Gieson (EVG)، H & E والمناعية مع VSMC SMA علامة وعلامة عموم الكريات البيض CD45. لم يلاحظ أي رفض الكسب غير المشروع بين C57BL/6J الفئران الذكور في زرع الشريان الأورطي. الذكور إلى الإناث: زرعأيون يسببها GA، تتميز تسلل الكريات البيض وتشكيل neointima مع تراكم VSMC (1B الشكل). لتحديد دور الإنترفيرون γ في اشارة GA، aortas من WT أو الإنترفيرون γR-KO الفئران تم زرع إلى المتلقي أنثى WT. حذف الإنترفيرون γR في ترقيع المانحة أظهرت انخفاض تسلل الكريات البيض وتشكيل neointima مع انخفاض قدره إيجابية الخلايا SMA مقارنة WT (لا يظهر). هذه النتائج تدعم دورا حاسما لالإنترفيرون γ في اشارة GA التقدم كما لوحظ سابقا في أنسنة الماوس طعم أجنبي زرع نموذج 4، 15، 17، 18.
الإنترفيرون γ التي يسببها تصلب الشرايين الكسب غير المشروع: لقد ثبت أن الإنترفيرون γalone كافية لإحداث وتشكيل neointima في ماوس أنسنة GA نموذج 15 و 17. هنا أنشأنا الماوس مسانج الكسب غير المشروع نموذج تصلب الشرايين الإنترفيرون γ بوساطة. في هذا النموذج، تم زرع aortas ذكر WTفي الفئران المتلقية الإنترفيرون γR التي تعاني من نقص تليها الحقن عن طريق الوريد من النسخ المتماثل التي تعاني من نقص اتش ترميز الماوس الإنترفيرون γ التحوير (AD-الإنترفيرون γ) أو سيطرة LacZ الجين (AD-LacZ) (الشكل 2A). تم التحقق من عدوى الكبد والكبد التعبير التحوير من الإعلان، وLacZ بواسطة تلطيخ X-غال في المجموعة الإعلانية-LacZ ولكن ليس الإعلان، والإنترفيرون γ مجموعات كما هو موضح سابقا 17. -γ IFN في المصل تم الكشف عن التعبير النظامية من عند مستوى 120-150 نانوغرام / مل في اليوم 3 واحتفظ تصل إلى 5 أسابيع في الإعلان، والإنترفيرون γ ولكن ليس في المجموعة LacZ. تم حصادها Aortas في 5 أسابيع بعد الحقن من اتش للتحليل النسيجي وتقييم المظهرية من الشريان الكسب غير المشروع البطانية، ووسائل الإعلام، والتجويف ومنطقة السفينة. التعبير عن الإنترفيرون γ، وليس سيطرة LacZ، تشكيل neointimal المستحث. تم الكشف عن تسلل واضح لا من الكريات البيض بالمقارنة مع النموذج طعم خيفي (الشكل 2B). هذه البيانات متسقة مع السابقةالملاحظات في أنسنة نموذج الفأر طعم أجنبي أن الإنترفيرون γ وحدها كافية لإحداث وتشكيل neointima 15، 17.
الشكل 1. التوضيح ومخطط الماوس طعم خيفي زرع الشريان نموذج. A. مثال على الإجراء زرع طعم خيفي. وموسط A جزء من المانحين ذكر الشريان الأورطي الصدري جراحيا في الشريان الأورطي البطني في مستلم الإناث. تم حصادها Aortas في 4 أسابيع بعد الزرع. كعنصر تحكم، شريحة من الذكور المانحة الشريان الأورطي الصدري وموسط جراحيا إلى الشريان الأورطي البطني في مستلم الذكور. B. التحليل النسيجي للترقيع الشريان بواسطة المرنة فان Gieson (EVG)، H & E والمناعية مع مكافحة-A-SMA ومكافحة CD45. وتظهر photomicrographs ممثل. النصال بمناسبة الصفيحة المرنة الداخلية لترسيم البطانية من وسائل الاعلام. جدولشريط: 50 مم. لم يلاحظ أي تصلب الشرايين الكسب غير المشروع في ذكر لمجموعة من الذكور.
الشكل 2. الإنترفيرون γ التي يسببها الماوس مسانج الشريان نموذج الزرع. A. A مخطط نموذج الفأر مسانج الإنترفيرون γ التي يسببها. وكان تشريح ذكر الشريان الصدري المانحة وزرعها في الشريان الأورطي البطني في ذكر المتلقي الإنترفيرون γR الفئران KO. بعد الجراحة أسبوع واحد، تم حقن 1X10 9 PFU الإعلان، وmIFN-γ أو الإعلان، وLacZ في الفئران المتلقي عبر الوريد الوداجي. تم جمع عينات من مصل في اليوم 3 و 7 و 35 بعد الحقن من الفيروسات لالإنترفيرون γ القياس. تم حصادها ترقيع 6 أسابيع لتقييم المظهرية. B. التحليل النسيجي للترقيع الشريان بواسطة المناعية مع مكافحة-A-SMA ومكافحة CD45. وتظهر photomicrographs ممثل. النصال بمناسبة الصفيحة المرنة الداخلية لترسيم البطانية من وسائل الاعلام. نطاق بع: 50 مم. لم يلاحظ أي تصلب الشرايين الكسب غير المشروع في LacZ المجموعة.
| خطوة | مشكلة | الأسباب المحتملة | حل |
| 2.17 | نزيف حاد | الفجوة (المسافة بين اثنين من غرز) كبير جدا، ولا سيما من الغرز توقف. | المسافة بين كل اثنين من غرز ينبغي أن تكون موحدة خلال مفاغرة. إضافة غرزة واحدة على موقع النزيف. |
| فقط هو مخيط البرانية. | تحديد وخياطة جدار الأبهر كله | ||
| فروع خشب Unligated | Ligating فروع خشب | ||
| استخدام الكثير من الهيبارين | باستخدام ما يصل إلى 40 مل / كغ heparinized (100 U / مل) محلول ملحي للري مجال جراحة خلال مفاغرة. | ||
| 2.19 | الجلطة | التجويف ضيق جدا في موقع توصيلي، ولا سيما من الغرز المستمر. | تجنب anastomosing كثيرة جدا جدار الأبهر في كل غرزة. حجم الشريان الأورطي من الفأر هو صغير جدا. سوف غرزة لعدد كبير جدا من جدار الأبهر خلال مفاغرة يسبب ضيق التجويف وتخثر الدم، ومع ذلك، سوف غرزة لجدار الأبهر يؤدي أيضا أقل في نزيف حاد. |
| تمرير الخيط من خلال جدار الشريان الأورطي في الجانب المقابل. | تحديد جدار الأبهر ومن ثم جعل غرز. إذا حدث ذلك، يجب على المشغل بقطع عقدة خياطة وإعادة غرزة في هذا الموقع. | ||
| وأصيب الخلايا البطانية خلال مفاغرة. | باستخدام الخيوط الجراحية إقامة لمفاغرة. لا يحملون / ضغط على جدار arotic كله بفضلالفطر الابيض للمفاغرة. | ||
| لا يتم استخدام الهيبارين خلال مفاغرة. | حجم الشريان الأورطي من الفأر هو صغير جدا. فمن السهل جدا لتكوين تجلط الدم في ترقيع بعد مفاغرة. إعطاء الهيبارين في ري مجال الجراحة مهم جدا للحد من تجلط الدم. نسبة نجاح زرع السفينة في الفئران حوالي 50٪ دون استخدام الهيبارين و95-100٪ مع استخدام الهيبارين. إذا تم العثور على تجلط الدم في غضون دقائق قليلة بعد استعادة تدفق الدم، وهو نهج بديل لإزالة الجلطة هي حقن محلول ملحي 30-50 ماي heparinied (100 U / مل) من خلال IVC. لا حقن الهيبارين كثيرا فقط في حالة نزيف حاد. | ||
| 2.23 | فشل الزرع | نزيف وتأخر تخثر الدم، أو غيرها | زرع السفينة في الفئران هي عملية جراحية صعبة جدا لحجم الشريان الأورطي من الفأر هو صغير جدا. هناك ثلاثة البوي الرئيسيةNTS لعملية جراحية ناجحة: 1) تأكد من anastomosed جدران الأبهر من المضيفة والمانحة معا دون الواضح الفجوة، فقط في حالة نزيف حاد، 2) الحفاظ على ما يكفي من الفضاء التجويف في موقع توصيلي، فقط في حالة تخثر؛ 3) استخدام الهيبارين في الجرعة المناسبة خلال مفاغرة، فقط في حالة تجلط الدم ونزيف حاد. بعد هذا البروتوكول، فإن نسبة النجاح لمقدم البلاغ هو أكثر من 95٪. |
الجدول 1. مخرج الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتركز البروتوكولات المذكورة على نماذج GA الماوس. يمكن تطبيق إجراءات لنماذج أخرى زرع الكسب غير المشروع. وتشمل هذه النماذج طعم أجنبي أنسنة (أي قطاعات الشريان التاجي الإنسان موسط في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي)، ورفض نموذج الفأر GA الحادة (أي الشريان الأورطي الفار من سلالة وراثية واحدة في المتلقي السلالة الجينية آخر). لدينا نماذج الماوس وصف أكثر ليغلق الآفات GA الإنسان. النموذج الأول ينطوي على مداخلة من شريحة سفينة من ماوس الذكور إلى مستلم الإناث من نفس السلالة الفطرية (C57BL/6J). يتم توجيه رفض الكسب غير المشروع في هذه الحالة فقط ضد مستضدات التوافق النسيجي طفيفة المشفرة بواسطة كروموسوم Y (موجودة في الذكور ولكن ليس الأنثى) واستجابة الرفض الذي تستتبعه هو كسلان بما فيه الكفاية للحفاظ على خلايا العضلات الملساء المانحة المستمدة لعدة أسابيع 2 و 6 ، 8-10، 12، 14. النموذج الثاني ينطوي على فاصلة segme الشريانNT من نوع البرية C57BL/6J المانحة الماوس إلى ماوس المضيف من نفس السلالة والجنس التي تفتقر إلى مستقبلات للالإنترفيرون γ (الإنترفيرون γR-KO)، يليه إدارة الماوس الإنترفيرون γ (تسليمها عن طريق العدوى من الفأرة الكبد مع متجه الفيروسة الغدانية.) لا توجد الرفض في هذه الحالة لأن كلا من الجهات المانحة والمتلقية الفئران هي من نفس السلالة والجنس ولكن الخلايا المانحة العضلات الملساء تتكاثر ردا على خلوى في حين أن الخلايا المشتقة من المضيف، وتفتقر إلى مستقبلات لهذا خلوى، لا تستجيب 21. وعلاوة على ذلك، من خلال backcrossing بتغيرات جينية إضافية إلى الجهة المانحة السفينة، كلا النموذجين يمكن استخدامها لتقييم تأثير جينات معينة على الإنترفيرون γ يحركها نحو سلس تكاثر الخلايا العضلية وGA التقدم.
دور الإنترفيرون γ في نماذج الماوس GA لم يتم راسخة. لقد التحقق لدينا نماذج الماوس اثنين دور الإنترفيرون γ في الماوس GA. في النموذج الأول، يتم زرعها في الشريان الأورطي المانحة الذكور إلى الإناث المتلقيةبحيث المضيف يدفع alloreactive T الردود منيع للمستضد الخيفي الخلية بوساطة ضد القاصر التوافق النسيجي HY المستضد الخاص بالذكور وأعرب عن ترقيع 12. في الواقع، WT (C57BL/6J) من الذكور إلى الإناث C57BL/6J زرع يسببها GA، يتميز تسلل الكريات البيض وتشكيل neointima مع تراكم VSMC. في المقابل، ذكر لزرع الشريان الأورطي الذكور لا يسبب GA. نحن مصممون دور الإنترفيرون γ يشير في خلايا الأوعية الدموية باستخدام الإنترفيرون γR-KO كما الكسب غير المشروع المانحة زرعها إلى المتلقي أنثى WT. حذف الإنترفيرون γR في ترقيع المانحة قلل تسلل الكريات البيض وتراكم VSMC في neointima. ولذلك، فإن دور الإنترفيرون γ في نموذج الفأر الحالي يتسق مع طعم أجنبي الماوس أنسنة نموذج زرع حيث الإنترفيرون γ يشير في الكسب غير المشروع أمر حاسم بالنسبة لتطور GA 4، 15، 17، 18. نحن مصممون إذا الإنترفيرون γ وحدها كافية لإحداث وتشكيل neointima عن طريق إنشاء الإنترفيرون γ-ميدىالماوس انبعاث العوادم مسانج نموذج تصلب الشرايين الكسب غير المشروع. في هذا النموذج، يتم زرعها في الشريان الأورطي ذكر إلى ذكر الحيوان الإنترفيرون γR-KO المتلقي في الماوس الذي الإنترفيرون γ ثم يتم التعبير بشكل منتظم عن طريق الحقن في الوريد من اتش النسخ المتماثل التي تعاني من نقص ترميز الماوس الإنترفيرون γ التحوير (AD-الإنترفيرون γ ). لاحظنا أن التعبير عن الإنترفيرون γ، وليس سيطرة LacZ، التي يسببها تشكيل neointimal. في هذا النموذج، لم يتم الكشف عن تسلل واضح من الكريات البيض بالمقارنة مع النموذج طعم خيفي، بما يتفق مع الملاحظات السابقة في الماوس الشريان-SCID نموذج زرع الإنسان في الأوعية الدموية التي الإنترفيرون γ إشارات وحدها كافية لإحداث وتشكيل neointima في غياب الكريات البيض 15، 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL109420 إلى WM وAHA 9320033N إلى LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
