Summary
Vi beskriver protokoller for vores mus graft arteriosclerois (GA) modeller, der involverer overdrage en mus karsegment ind i en modtager af samme indavlede stamme. Ved tilbagekrydsning yderligere genetiske ændringer i skibets donor kan modellen vurdere effekten af specifikke gener på GA.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), også kaldet allotransplantat vaskulopati, er en patologisk læsion, der udvikler sig over måneder til år i transplanterede organer karakteriseret ved diffus, periferisk stenose af hele graft vaskulære træ. Den mest kritiske komponent i GA patogenese, er spredningen af glatte muskel-lignende celler i intima. Når en human koronararterie segment er indskudt i den infra-renale aorta af immunsvækkede mus, kunne INTIMAS kunne ekspandere som reaktion på adoptivt overførte humane T-celler allogene til arterien donor eller exogene humane IFN-γ i fravær af humane T-celler. Overdrage en mus aorta fra en stamme til en anden musestamme modtager er begrænset som en model for kronisk afstødning hos mennesker, fordi den akutte cellemedieret afstødningsreaktion i denne musemodel helt eliminerer alle donor-afledte vaskulære celler fra transplantat under to, tre uger. Vi har for nylig udviklet to nye mOuse modeller til at omgå disse problemer. Den første model indebærer indskydning af et fartøj segment fra en mandlig mus i en kvindelig modtager af samme indavlede stamme (C57BL/6J). Afstødning i dette tilfælde kun er rettet mod mindre histokompatibilitetsantigener kodes af Y-kromosomet (stede i den mandlige men ikke kvindelige) og afstødningsreaktion at ensues er tilstrækkelig indolent at bevare donor-afledte glatte muskelceller i flere uger. Den anden model indebærer indskyde en arterie segment fra en vildtype C57BL/6J mus donor i en vært mus af samme stamme og køn, som mangler receptoren for IFN-γ efterfulgt af administration af muse IFN-γ (leveret via infektion af mus lever med en adenovirusvektor. Der er ingen afvisning i dette tilfælde som både donor og recipientmus er af samme stamme og køn, men donor glatte muskelceller proliferere som respons på cytokinet mens værtsafledt celler, der mangler receptor fordette cytokin er afvisende. Ved tilbagekrydsning yderligere genetiske ændringer i skibets donor, kan begge modeller anvendes til at vurdere effekten af specifikke gener på GA progression. Her beskriver vi detaljerede protokoller for vores mus GA modeller.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), også kaldet allotransplantat vaskulopati, er en patologisk læsion, der udvikler sig over måneder til år i transplanterede organer karakteriseret ved diffus, periferisk stenose af hele graft vaskulære træ 7.. Tidlige stadier kan forårsage excentriske og fokal stenoser, der er mere tydelig i arterierne, således mere ligner stenoser ses i konventionel åreforkalkning. Hulrummet tab af transplantatkar resultaterne fra intimal ekspansion grund infiltration af værten T-celler og makrofager og især akkumulering af ekstracellulær matrix og på glatte muskler lignende cellerne stammede fra transplantat, vært eller begge 5, 13, 19, at er utilstrækkeligt kompenseret ved passiv fartøj remodellering. I hjerteallografter, er de mest klinisk signifikante læsioner de i epikardielle og intramyocardial koronararterier. I sidste ende vil GA af kranspulsårerne forårsage iskæmisk hjertesvigt. GA er den største årsag til sent hjerte gr.agterude tab. De stenoser GA stopper ved sutur linjer, stærkt implicerer værtsreaktionen podede alloantigener i sin patogenese og fører os til at klassificere GA som en form for kronisk afstødning 3.. Imidlertid kan andre former for arteriel skade øger risikoen for GA, enten ved at øge nettobyrde for skade eller ved at intensivere og / eller modulering af alloimmun respons. Endotelcelle (EF) foring af graft arterier er bevaret i human GA og de mest overfladiske områder af intima støder op til EF foring er stedet hårdest infiltreret af værtsafledt IFN-γ-producerende T-celler og makrofager 11; i nogle patienter GA er forbundet med udvikling af donor-specifikke alloantistoffer der binder til pode EF 16 men skibene viser ringe tegn på den fibrinoid nekrose der er karakteristisk af akut antistof-medieret afstødning 11.
Den mest kritiske komponent i GA patogenese denproliferation af glatte muskel-lignende celler i intima, hvis denne proces kan blive anholdt, GA er usandsynligt, at fremskridt. Tidligere arbejde fra vores gruppe havde vist, at INTIMAS af humane koronararterie segmenter indskudt i infra-renal aorta af immunsvækkede mus ekspandere som reaktion på adoptivt overførte humane T-celler allogene til arterien donor, og at denne proces kunne inhiberes ved at neutralisere humane IFN- γ 18. Desuden exogene humane IFN-γ kan forårsage intima (og mediale) vaskulære glatte muskelceller (VSMC) proliferation i disse arterielle transplantater i fravær af humane T-celler 15, 17. (Det er vigtigt at bemærke, at mennesker og mus IFN-γ ikke krydse arter, udelukker indirekte virkninger på musen vært i denne eksperimentelle system.) Disse humaniseret musemodeller har gavn af opridset human T-celle / vaskulære celleinteraktioner, og intima læsioner er hovedsagelig sammensat af human (dvs. graft-afledte celler)som er blevet observeret i kliniske prøver, men de har ikke helt gentage den kliniske situation, fordi de ignorerer den rolle vært makrofager og muligvis andre celletyper involveret i kliniske transplantation læsioner. En konventionel musemodel af denne proces kunne teoretisk løse dette problem, der supplerer de begrænsninger af det humaniserede model ved at inddrage en komplet værtimmunsystemet og giver den yderligere fordel af at tillade strømmen af muse genetiske metoder, der skal anvendes til GA. De to mest anvendte musemodeller involverer heterotopisk hjerte transplantation og ortotopisk arterie transplantation 1.. De læsioner, der udvikles i arterierne i heterotopisk hjertetransplantater er overvejende udgøres af værtsceller, sandsynligvis af knoglemarv oprindelse, mens intimale celler i arterierne i humane hjertetransplantater er overvejende af graft oprindelse 5, 13, 19. Dette er en væsentlig forskel, der har ført os til at udvikle alternative musemodeller. Indskudten mus aorta fra en stamme til en anden musestamme modtageren er endnu mere begrænset som en model for kronisk afstødning hos mennesker, fordi den akutte cellemedieret afstødningsreaktion i denne musemodel helt eliminerer alle donor-afledte vaskulære celler fra transplantat under to, tre uger 19.. Derfor de efterfølgende ændringer, der ses i det indskudte karsegment alene er en respons på værts celler, der har genbefolket at decellulariserede skibet stillads, hvilket skaber en meget kunstig situation med begrænset relevans som model for ændringerne i transplantatkar der opstår i klinikken. Vi har for nylig udviklet to nye musemodeller at omgå disse problemer 21.. Den første model indebærer indskydning af et fartøj segment fra en mandlig mus i en kvindelig modtager af samme indavlede stamme (C57BL/6J). Den anden model indebærer indskyde en arterie segment fra en vildtype C57BL/6J mus donor i en vært mus af samme stamme og køn, der mangler receptor for IFN-γ (IFN-yR-KO) efterfulgt af administration af muse IFN-γ (leveret via infektion af museleverens med en adenovirusvektor. Her beskriver vi detaljerede protokoller og fordelene ved vores mus GA modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus allograft og syngene graft transplantationer model
Alle dyreforsøg blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og bruge udvalg af Yale University. For allograft model blev segmenter af thorax aorta fra mænd, 4-5 uger gamle WT (C57BL/6J) eller IFN-yR-KO-mus indskudt i den abdominale aorta af kvindelig modtager, 8-12 uger gamle WT ved hjælp af en ende-til udgang microsurgical anastomotisk teknik (se næste for detaljer). For syngenisk graft model blev segmenter af thorax aorta fra mandlige, 4-5 uger gamle WT mus indskudt i den abdominale aorta af mandlige, 8-12 uger gamle IFN-γR1-KO ved hjælp af en end-to-end microsurgical anastomotic teknik. På en uge postoperativt blev dyrene inokuleret iv med Ad5.CMV-muse IFN-γ eller Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) ved 1 x 10 9 PFU. Serum muse IFN-γ-niveauer blev målt ved ELISA (eBioscience) ved 1 og 5 uger efter indgivelse adenovirus administration. Visse dyr modtog BrdU(Sigma-Aldrich) ved 100 mg / kg sc i 2 uger før aflivning.
End-to-end microsurgical anastomotisk teknik (Video vil blive taget for denne del):
1.. Donor Procedure
- Anesthetize donormus med intraperitoneale injektioner af ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- Efter at sikre tilstrækkelig anæstesi, placere donormus under operationsmikroskopet på X8-30 forstørrelse på en bakke i liggende stilling og bruge Jod Prep Pad og alkohol Prep Pad for brystvæggen forberedelse.
- Incise forreste brystvæg gennem ribben og mellemgulv at blotlægge hjertet.
- Åbn højre atrium, injicere 10 ml hepariniseret (100 U / ml) saltopløsning i den venstre ventrikel for at skylle de mus med en 10-ml sprøjte med en 25-gauge nål.
- Resect hjertet og lungerne at eksponere hele længden af thorakalaorta.
- Dissekere thorakalaorta omhyggeligt for at minimere den direkte traumer, while identificere ligere og opdele tømmer grene ved hjælp 11-0 sutur nær aorta.
- Når thorakalaorta er fri fra omgivende væv, udskære hele thorakalaorta til transplantation.
- Skyl den afskårne ende af donor aorta med hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning, og opbevar den i den samme opløsning på is (op til 6 timer), indtil transplantation.
2.. Modtager Procedure
- Injicer recipientmus med ip ketoprofen (5 mg / kg) for analgesi, og thenanesthetize musene med IP ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). De modtagende mus er dybt bedøvet inden for 10 minutter for en varighed på 60-90 minutter. Under operationen, er niveauet af anæstesi vurderes hvert 15 min ved at klemme den forreste bugvæggen eller fod ved hjælp af pincet. Hvis dyret reagerer på skadelige stimuli når som helst under operationen, vil en ekstra dosis af ketamin og xylazin (1/4 eller 1/3 oprindelige dosis) administreres af sc eller im
- Efter at sikre tilstrækkelig anæstesi, off barbere pelsen i den forreste del af bugvæggen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, rense huden ved hjælp af jod Prep Pad og alkohol Prep Pad, dække øjnene med oftalmologiske salve. Under operationen vil følgende aseptisk teknik skal bruges til driften, herunder rengøring operationsbordet med 10% blegemiddel, iført sterile handsker og bruge steriliserede mikrokirurgi instrumenter (dampsteriliseret instrumenter til starten af operationen, så varme glas perle-steriliseret instrumenter mellem flere operationer osv.).
- Placer recipientmus under operationsmikroskopet med en forstørrelse på X8-30 på en bakke i liggende stilling.
- Incise bugvæggen ved midterlinjen fra xyphoid til pubis, og sprede bugvæggen hinanden ved hjælp af en mikro-retractor at eksponere bughulen.
- Træk tarmene overlegent og wrap med gaze fugtet med saltvand. De modtagende mus bliver kølet af tab af heat gennem eksternaliserede tarme. Det er vigtigt at fastholde dyr varme. Imidlertid er opvarmningen bord ikke anvendes under operationen som beskedne hypotermi er en fordel i at forhindre rygmarvsskade under okklusion af aorta blodgennemstrømning såvel som der er ineffektiv varmeoverførsel med fraværende blodtilførslen til den nederste halvdel af musene krop.
- Flyt de reproduktive organer inferiorly, wrap maven områder recipientmus med saltvand-løsningen gaze, og bruge det til at trække endetarmen til højre side af maven. De eksponerede væv vandes regelmæssigt med saltvandsopløsning under transplantation.
- Dissekere omsvøb et segment af infrarenal aorta mellem renal fartøj proksimalt og aortaforgreningen distalt og adskille fra vena cava inferior (IVC) omhyggeligt.
- Identificere og ligere alle de små grene stammer fra dette segment af abdominal aorta ved hjælp 11-0 Polyamid Monofilament sutur.
- Cross-klemme den isolerede segment af etbdominal aorta ved hjælp af to vaskulære klemmer kring 5 mm fra hinanden, en i hver ende.
- Transekt den abdominale aorta mellem klemmerne ved hjælp af Sharps mikro-saks til at skabe de anastomotiske sites.
- Resect et lille segment af abdominal aorta (op til 0,4 mm i længden) fra den ene afskårne ende af transected modtager aorta at rumme donor aortagraft.
- Skyl aorta segmenter mellem klemmer hjælp hepariniseret saltopløsning for at fjerne overskydende blod. Aorta segmenter mellem klemmer og donor aorta graft er vandet med jævne mellemrum med hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning (op til 40 ml / kg) under anastomose.
- Transektere begge sider af donor aorta og skarpe mikrosakse at skabe et segment transplantat i en 2.5 mm i længden til transplantation.
- Placer donor aortagraft i ortotopisk position, anastomose donor graft proksimale og distale ende til modtagerens proximale og distale afskårne ende af abdominal aorta, henholdsvis med en ende-to-end mønster ved hjælp 11-0 Polyamid Monofilament sutur.
- For de kontinuerlige suturer, placere ophold suturer på 3 og 09:00 positioner første. Mellem to stay suturer på hver side af graft, binde anastomose både afskårne kanter i 3-4 sting ved hjælp af kørende suturer og de løbende suturer at bo suturer en dobbelt knude. Da begge lag lukning er kontinuerlig, er risikoen opspringningsprocessen øget. Donoren aortagraft bør være i passende længde til at forbinde modtagerens proximale og distale afskårne ende af abdominal aorta.
- For de afbrudte suturer, konstruere fire anastomose på 3 og 09:00 positioner i begge sider af graft første, og anastomose både afskårne kanter i 3-4 sting mellem to stay suturer på hver side af graft.
- Slip distale klemme til at tillade retrograd flow ind graft, identificere de blødende steder og foretage yderligere masker inden for 3 minutter.
- Efter at have sikret tilfredsstillende hæmostase, slipper den proksimale klemme.
- Bekræft graft passage ved tilstedeværelse af kraftig pulsering i transplantatet og den proximale tilstødende segment af nativ abdominale aorta, især i den distale tilstødende segment af abdominale aorta og ringere mesenterialarterie. Overvej trombose i anastomotiske sites, hvis pulsering aftage inden for et par minutter efter restaurering af blodgennemstrømningen.
- Retur tarmene i bughulen.
- Suturere lukke bugvæggen hjælp 5-0 Nylon sutur i muskel lag og hudlag, hhv.
- Placer recipientmus i en ren bur på toppen af en varmepude, og vent 1-2 hr for musene at genvinde bevidstheden og komme anæstesi. Det er vigtigt at fastholde dyr tilstrækkelig varme under restitution. Hold mus i varme og tørre bur før dyr wake fra bedøvelse.
- Vurdere motorik af bagbenene efter mus opsving, og igen på den anden dag. En vellykket transplantation kirurgi vil blive bekræftet if ikke dysfunktion af bagben er observeret i recipientmus på andendagen.
- Administrere recipientmus med ketoprofen i drikkevand (5 mg / kg / d = 27 ug / ml i drikkevand) i 48 timer. Hvis der recipientmus lider af smerter unrelieved de postoperative analgetika som det fremgår af tabet af mobilitet, manglende groom, unormal bundter kropsholdning, osv., vil de blive aflivet. Dyrene vil blive aflivet foruddefinerede endepunkter efter 1-60 dage.
Graft analyse
Artery transplantater i allotransplantat blev anskaffet ved 4 uger og transplantater i syngene graft model var 6 uger postoperativt (5 uger efter virusinfektion) og analyseret ved standard histologiske teknikker til Elastica van Gieson-(EVG) farvning, hematoxylin og eosin (HE) farvning og immunofluorescensfarvning. Billeder blev taget med et immunofluorescens mikroskopsystem (Zeiss). Celletælling af kerner omgivet af positiv immunfarvning var udføreed under høj forstørrelse og gennemsnit af 5 tværsnit for hver graft. De podede arealmålinger i lumen (indenfor endothelium), intima (mellem endotelet og interne elastiske lamina, IEL), medier (mellem IEL og ydre elastisk lamina, EEL), vægtykkelse (mellem endotelet og ekstern elastisk lamina) og hele skibet (i EEL) blev beregnet ud fra 5 serielle tværsnit, 150 um mellemrum for hver graft, med computerstøttet billedanalyse og NIH billede 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Statistisk analyse
Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM. Tosidede blev parvise t test og en to-vejs ANOVA analyse udført med Prism software program (GraphPad Software). Forskelle med P <0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus allograft åreforkalkning (GA) model: I denne model er en mandlig donor aorta transplanteret ind kvindelig modtager, så at værten inducerer alloreaktive T-cellemedieret alloimmun responser mod en mindre Y-antigen (den mandlige-specifikke mindre histokompatibilitetsantigen HY) udtrykt på transplantatet 12, og til gengæld T-celle-producerede IFN-γ drev VSMC proliferation 20 som observeret i andre allotransplantation modeller 2, 6, 8-10, 14,. Et segment af thorakalaorta fra en donor han blev kirurgisk indskudt i en abdominal aorta af en kvindelig modtager, og aorta blev høstet efter 4 uger efter transplantationen (figur 1A). Histologisk analyse af arterie podninger blev udført af Elastica-van Gieson (EVG), H & E og immunfarvning med VSMC markør SMA og pan-leukocyt markør CD45. Ingen afstødning blev observeret mellem C57BL/6J hanmus i aorta transplantation. Mand til Kvinde transplantation induceret GA, kendetegnet ved infiltration af leukocytter og dannelsen af neointima med akkumulering af VSMC (figur 1B). At bestemme rollen af IFN-γ-signalering i GA, Aortas fra WT eller IFN-yR-KO-mus blev transplanteret til WT kvindelig modtager. Sletning af IFN-yR i donor transplantater udviste en reduceret infiltration af leukocytter og dannelsen af neointima med fald SMA-positive celler i forhold til WT (ikke vist). Disse resultater understøtter en afgørende rolle for IFN-γ-signalering i GA progression som tidligere observeret i humaniseret mus xenograft transplantation model 4, 15, 17, 18.
IFN-γ-induceret graft åreforkalkning: Det er blevet fastslået, at IFN-γalone er tilstrækkelig til at inducere dannelsen af neointima i en humaniseret mus GA model 15, 17. Her har vi etableret et IFN-γ-medieret mus syngenisk graft åreforkalkning model. I denne model blev WT mandlige aortaer transplantereti IFN-yR-deficiente recipientmus efterfulgt af intravenøst injektion af replikations-deficient adenovirus koder muse IFN-γ transgen (Ad-IFN-γ) eller kontrol-LacZ-genet (Ad-LacZ) (figur 2A). Hepatiske infektion og lever transgen ekspression af Ad-LacZ blev bekræftet ved X-gal farvning i Ad-LacZ gruppe, men ikke de Ad-IFN-γ grupper som beskrevet tidligere 17.. Systemisk ekspression af IFN-γ i serum blev påvist ved et niveau på 120-150 ng / ml på dag 3 og opbevares op til 5 uger i Ad-IFN-γ men ikke i LacZ-gruppen. Aortaer blev høstet på fem uger post-injektion af adenovirus for histologisk analyse og morfometrisk vurdering af arterie graft intima, medier, lumen og skib område. Ekspression af IFN-γ, men ikke LacZ kontrol, induceret neointimale formation. Ingen indlysende infiltration af leukocytter blev detekteret i forhold til allograft model (figur 2B). Disse data er i overensstemmelse med den tidligereobservationer i humaniseret mus xenograft model, IFN-γ alene er tilstrækkelig til at inducere dannelsen af neointima 15, 17.
Figur 1. Illustration og opbygningen af muse allograft arterie transplantation model. A. En illustration af allotransplantation procedure. Et segment af donor mandlige thorakalaorta blev kirurgisk indskudt i abdominale aorta i en kvindelig modtager. Aortaer blev høstet efter 4 uger efter transplantationen. Som en kontrol blev et segment af mandlig donor thorakalaorta kirurgisk indskudt i en abdominal aorta i en mandlig recipient. B. Histologisk analyse af arterie transplantater ved Elastica-van Gieson (EVG), H & E og immunfarvning med anti-a-SMA og anti-CD45. Repræsentative mikrofotografier vises. Pilespidser markere indre elastiske lamina at afgrænse intima fra medierne. Scalebar: 50 mm. Ingen graft åreforkalkning blev observeret i mandlige til mandlige gruppe.
Figur 2. IFN-γ-induceret muse syngene arterie transplantation model. A. En ordning af IFN-γ-induceret muse syngene model. Mandlig donor thorax arterie blev dissekeret og transplanteres ind i abdominale aorta hos mandlige modtager IFN-yR KO mus. En uge efter kirurgi blev 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ eller Ad-LacZ injiceret i recipientmus via halsvenen. Serum blev opsamlet på dag 3, 7 og 35 efter injektion af virus for IFN-γ måling. Transplantater blev høstet 6 uger til morfometrisk vurdering. B. Histologisk analyse af arterie transplantater ved immunfarvning med anti-a-SMA og anti-CD45. Repræsentative mikrofotografier vises. Pilespidser markere indre elastiske lamina at afgrænse intima fra medierne. Scale bar: 50 mm. Ingen graft åreforkalkning blev observeret i LacZ gruppe.
| Trin | Problem | Mulig årsag | Opløsning |
| 2,17 | Alvorlig blødning | Mellemrummet (afstanden mellem to masker) er for stor, navnlig af afbrudte suturer. | Afstanden mellem hver to masker bør være ensartet under anastomose. Tilføj en maske på blødning site. |
| Kun adventitia er syet. | Identifikation og syning hele aortavæg | ||
| Ligerede tømmer grene | Ligering Tømmerarbejdernes grene | ||
| Bruge for meget heparin | Brug op til 40 ml / kg hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning at overrisle kirurgi feltet under anastomose. | ||
| 2,19 | Trombose | Lumen er for smal til anastomotiske sted, navnlig af kontinuerlige suturer. | Undgå anastomoserende for mange aortavæg ved hver søm. Aorta størrelse mus er meget lille. At sy for mange aortavæg under anastomose vil forårsage lumen smalle og trombose, vil dog at sy også mindre aortavæggen resultere i alvorlig blødning. |
| Suturen passerer gennem aorta væggen i den modsatte side. | Identifikation af aorta væggen og derefter gøre sting. Hvis den skete, bør operatøren afbrød sutur knude og re-søm på dette site. | ||
| Endotelceller kommer til skade under anastomose. | Brug af ophold suturer for anastomose. Hold ikke / presse hele arotic væg ved forceps til anastomose. | ||
| Heparin ikke anvendes under anastomose. | Aorta størrelse mus er meget lille. Det er meget nemt for trombose dannelse i de podninger efter anastomose. Give heparin at overrisle operationen felt er meget vigtig for at reducere thrombose. Succesraten for fartøjets transplantation i mus er omkring 50% uden anvendelse heparin og 95-100% med hjælp heparin. Hvis trombose er fundet inden for et par minutter efter genoprettelse af blodgennemstrømningen, en alternativ fremgangsmåde til at fjerne trombose er at injicere 30-50 ul heparinied saltvandsopløsning (100 U / ml) gennem IVC. Må ikke injiceres for meget heparin bare i tilfælde af alvorlig blødning. | ||
| 2,23 | Transplantation mislykkedes | Forsinket blødning og trombose, eller andre | Fartøjet transplantation i mus er meget vanskelig operation for aorta størrelse mus er meget lille. Der er tre vigtige poiNTS for en vellykket operation: 1) Sørg for aorta mure vært og donor er anastomoseres sammen uden åbenbart hul, bare i tilfælde af alvorlig blødning, 2) at holde tilstrækkelig lumen plads anastomotiske sted, bare i tilfælde af trombose 3) brug heparin i en højre dosis under anastomose, bare i tilfælde af trombose og alvorlige blødninger. Efter denne protokol, er succesraten for forfatteren mere end 95%. |
Tabel 1. Problemløsning bordet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne protokoller er fokuseret på musen GA modeller. De procedurer kan anvendes til andre podede transplantation modeller. Disse modeller inkluderer humaniseret xenograft (dvs. menneskelige kranspulsåren segmenter indskudt ind i den infra-renal aorta af immunsvækkede mus) og akut afstødning muse GA model (dvs. en mus aorta fra en genetisk stamme til en anden genetisk stamme modtager). Vores beskrevne musemodeller er mere at lukke humane GA læsioner. Den første model indebærer indskydning af et fartøj segment fra en mandlig mus i en kvindelig modtager af samme indavlede stamme (C57BL/6J). Afstødning i dette tilfælde kun er rettet mod mindre histokompatibilitetsantigener kodes af Y-kromosomet (stede i den mandlige men ikke kvindelige) og afstødningsreaktion at ensues er tilstrækkelig indolent at bevare donor-afledte glatte muskelceller i flere uger 2, 6 , 8-10, 12, 14. Den anden model indebærer indskyde en arterie segment fra en vildtype C57BL/6J mus donor i en vært mus af samme stamme og køn, som mangler receptoren for IFN-γ (IFN-yR-KO) efterfulgt af administration af muse IFN-γ (leveret via infektion af mus lever med en adenovirusvektor.) Der er ingen afvisning i dette tilfælde som både donor og recipientmus er af samme stamme og køn, men donor glatte muskelceller proliferere som respons på cytokinet mens værtsafledt celler, der mangler receptor for dette cytokin, reagerer ikke 21. Endvidere ved tilbagekrydsning yderligere genetiske ændringer i fartøjets donor, kan begge modeller anvendes til at vurdere virkningen af specifikke gener på IFN-γ-drevet proliferation af glatte muskelceller og GA progression.
Rollen af IFN-γ i muse GA modeller er ikke blevet veletableret. Vores to musemodeller har bekræftet den rolle IFN-γ i muse GA. I den første model er en mandlig donor aorta transplanteret ind kvindelig modtagersåledes at værten inducerer alloreaktive T-cellemedieret alloimmun responser mod den mandlige-specifikke mindre histokompatibilitetsantigen HY udtrykt på transplantaterne 12. Faktisk WT (C57BL/6J) han til C57BL/6J kvindelige transplantation induceret GA, karakteriseret ved infiltration af leukocytter og neointima formation med VSMC akkumulation. Derimod behøver han til mandlige aorta transplantation fremprovokere GA. Vi bestemt rollen af IFN-γ signalering i vaskulære celler ved hjælp af IFN-yR-KO som donor graft transplanteret til WT kvindelig modtager. Sletning af IFN-yR i donor podninger afstumpet leukocytinfiltration og VSMC ophobning i neointimaet. Derfor rolle IFN-γ i nuværende musemodel er i overensstemmelse med det humaniserede muse xenograft transplantation model, hvor IFN-γ signalering i transplantat er kritisk for GA progression 4, 15, 17, 18. Vi bestemmes, hvis IFN-γ selv er tilstrækkelig til at inducere dannelsen af neointima skabelsen af et IFN-γ, mediated mus syngene graft åreforkalkning model. I denne model er en mandlig aorta transplanteret ind i en mandlig IFN-yR-KO recipientdyrets hvori muse IFN-γ derefter systemisk udtrykt ved intravenøst injektion af replikations-deficient adenovirus koder muse IFN-γ transgen (Ad-IFN-γ ). Vi observerede, at ekspression af IFN-γ, men ikke LacZ kontrol inducerede neointimale formation. I denne model, er ingen indlysende infiltration af leukocytter detekteres i forhold til allograft model, stemmer overens med de tidligere observationer i en human arterie, SCID mus transplantation model, hvor vaskulær IFN-γ-signalering alene er tilstrækkelig til at inducere dannelsen af neointima i fravær af leukocytter 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01 HL109420 til WM og AHA 9320033N til LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
