Summary
Vi beskriver protokoller for våre mus pode arteriosclerois (GA) modeller som innebærer interposition av en mus fartøy segmentet til en mottaker av samme innavlet stamme. Ved tilbakekryssing flere genetiske forandringer i skipet donor, kan modellen vurdere effekten av spesifikke gener på GA.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), også kalt allograft vaskulopati, er en patologisk lesjon som utvikler seg over måneder eller år i transplanterte organer karakterisert ved diffus, omkrets-stenose av hele graftet vaskulære treet. Den mest kritiske del av GA patogenesen er proliferasjonen av glatte muskel-lignende celler i intima. Når et menneske koronararterie segment er innskutt inn i det nedenfor nyrene-aorta av immundefekte mus, kunne bli intimas ekspandere som respons på adoptively overførte humane allogene T-celler til arterien donor eller eksogen human IFN-γ i fravær av humane T-celler. Interposition av en mus aorta fra en stamme til en annen mus belastning mottaker er begrenset som en modell for kronisk avvisning hos mennesker fordi den akutte celle-mediert avvisning respons i denne musemodellen fullstendig eliminerer alle donor-deriverte celler fra den vaskulære transplantat innenfor to til tre uker. Vi har nylig utviklet to nye mOuse modeller for å omgå disse problemene. Den første modellen involverer interposition av et fartøy segment fra en hann mus i en kvinnelig mottager av den samme innavlet stamme (C57BL/6J). Transplantatavstøtning i dette tilfellet er rettet kun mot mindre histocompatibility antigener kodet av Y-kromosom (tilstede i den mannlige men ikke den hunn) og den avvisende reaksjon som følger er tilstrekkelig lat for å bevare donor-deriverte glatte muskelceller i flere uker. Den andre modellen innebærer interposing en arterie segment fra en villtype C57BL/6J mus donor i en vert mus av samme stamme og kjønn som mangler reseptoren for IFN-γ etterfulgt av administrering av mus-IFN γ (levert via infeksjon i mus liver med en adenoviral vektor. Det er ingen avvisning i dette tilfelle både som giver-og mottaker-mus er av samme stamme og kjønn, men donor glatte muskelceller spre seg i respons på cytokin mens verts-avledede celler, mangler reseptor fordette cytokin, reagerer ikke. Ved tilbakekryssing flere genetiske forandringer i skipet donor, kan begge modellene brukes til å vurdere effekten av spesifikke gener på GA progresjon. Her beskriver vi detaljerte protokoller for våre mus GA-modeller.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), også kalt allograft vaskulopati, er en patologisk lesjon som utvikler seg over måneder eller år i transplanterte organer karakterisert ved diffus, omkrets-stenose av hele graftet vaskulære tre 7. Tidlige stadier kan forårsake eksentriske og fokale stenoser som er mer opplagt i arteries, og dermed nærmere ligner stenoser sett i konvensjonell aterosklerose. Lumen tap av graftet fartøy resultatene fra intimal utvidelse på grunn av infiltrering av vert T-celler og makrofager, og spesielt til akkumulering av ekstracellulær matriks og glatte muskel-celler som stammer fra transplantatet, vert eller begge 5, 13, 19, som er tilstrekkelig kompensert av ytre fartøy ombygging. I kardiale allografts, de klinisk signifikante lesjoner er de i epikardiale og intramyocardial koronararteriene. Til syvende og sist vil GA av koronararteriene forårsake iskemisk hjertesvikt. GA er den viktigste årsaken til sent hjertestans grakterut tap. De stenose i GA stoppe på suture linjene, sterkt implicating verten respons til pode alloantigener i patogenesen sin, og fører oss til å klassifisere GA som en form for kronisk avvisning tre. Imidlertid kan andre former for arteriell skade øke risiko for GA, enten ved å øke den netto byrden av skade eller ved å forsterke og / eller modulere alloimmun respons. Den endotelceller (EF) foring av pode arteries er bevart i menneskelig GA og de mest overfladiske regioner av intima tilknytning til EF fôr er stedet mest tungt infiltrert av host-derived IFN-γ-produserende T-celler og makrofager 11, i noen pasienter GA er forbundet med utvikling av donor-spesifikke alloantibodies som binder til pode EC 16 men fartøyene lite tydelig av den fibrinoid nekrose som er karakteristisk for akutt antistoff-mediert avvisning 11..
Den mest kritiske del av GA patogenesen erspredning av glatte muskel-lignende celler i intima, hvis denne prosessen kan bli arrestert, er GA usannsynlig å gå videre. Tidligere arbeid fra gruppe vår hadde vist at intimas fra humane koronararteriespasmer segmenter innskutt inn i det nedenfor nyrene-aorta av immundefekte mus ekspandere som respons på adoptively overførte humane allogene T-celler til arterien donor, og at denne prosess kunne inhiberes ved å nøytralisere human IFN- γ 18. Videre eksogen human IFN-γ kunne forårsake intimal (og mediale) vaskulære glatte muskelceller (VSMC) proliferasjon i disse arterielle grafts i fravær av humane T-celler 15, 17. (Det er viktig å merke seg at mennesker og mus IFN-γ ikke krysse arter, utelukker indirekte virkninger på mus vert i denne eksperimentelle systemet.) Disse humanisert musemodeller har fordelen av rekapitulere human T-celle / vaskulære celle interaksjoner og intimal lesjoner er i stor grad består av mennesker (dvs. graft-avledet) celler,som har blitt observert i kliniske prøver, men de har ikke fullt rekapitulere den kliniske situasjonen fordi de ignorerer rollen som vert makrofager og eventuelt andre celletyper som er involvert i kliniske transplantasjon lesjoner. En vanlig mus modell av denne prosessen kan teoretisk løse dette problemet, sammenfallende med begrensningene av humanisert modellen ved å involvere en hel rekke immunsystem og gir den ekstra fordelen av å la kraften av mus genetiske metoder som skal brukes til GA. De to mest brukte mus modeller innebære heterotop hjertetransplantasjon og orthotopic arterie transplantasjon en. Lesjoner som utvikler seg i arteriene i heterotop hjerte grafts er i stor grad består av vertscellene, sannsynligvis av benmargen opprinnelse, mens intimale celler i arteriene i menneskets hjerte grafts er hovedsakelig av pode opprinnelse 5, 13, 19. Dette er en betydelig forskjell som har ført oss til å utvikle alternative mus modeller. Interposition aven mus aorta fra en stamme til en annen mus belastning mottaker er enda mer begrenset som en modell for kronisk avvisning hos mennesker fordi den akutte celle-mediert avvisning respons i denne musemodellen fullstendig eliminerer alle donor-deriverte celler fra vaskulære transplantatet innenfor to til tre uker 19. Følgelig de påfølgende endringer sett i interposed fartøy segmentet er utelukkende en reaksjon av verten celler som har skar den decellularized fartøy stillas, skaper en svært kunstig situasjon med begrenset relevans som en modell for endringer i pode fartøy som oppstår i klinikken. Vi har nylig utviklet to nye musemodeller å omgå disse problemene 21. Den første modellen involverer interposition av et fartøy segment fra en hann mus i en kvinnelig mottager av den samme innavlet stamme (C57BL/6J). Den andre modellen innebærer interposing en arterie segment fra en villtype C57BL/6J mus donor inn i en rekke mus av samme stamme og kjønn som mangler receptor for IFN-γ (IFN-γR-KO) etterfulgt av administrering av mus IFN-γ (levert via smitte av musen lever med en adenovirusvektor. Her beskriver vi detaljerte protokoller og fordelene ved våre mus GA-modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus allograft og syngen pode transplantasjon modell
Alle dyrestudier ble godkjent av den institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer ved Yale University. For allograft modell, ble deler av thorakalaorta fra mannlig, 4-5 uker gamle WT (C57BL/6J) eller IFN-γR-KO mus anbragt i abdominal aorta av kvinnelige mottaker, 8-12 uker gamle WT bruker en ende-til -end microsurgical anastomotisk teknikk (se neste for detaljer). For syngen pode modell, ble deler av thorax aorta fra mannlige, 4-5 uker gamle WT mus anbragt i abdominal aorta av mannlig, 8-12 uker gamle IFN-γR1-KO med en ende-til-ende microsurgical anastomotisk teknikk. På en uke etter operasjonen, ble dyrene vaksinert iv med Ad5.CMV-mus IFN-γ eller Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) på 1 x 10 9 PFU. Serum mus IFN-γ-nivåer ble målt ved ELISA (eBioscience) ved 1 og 5 uker etter administrasjon adenovirus. Visse dyr fikk BrdU(Sigma-Aldrich) ved 100 mg / kg SC for to uker før ofring.
Ende-til-ende microsurgical anastomotisk teknikk (Video vil bli tatt for denne delen):
En. Donor Prosedyre
- Anesthetize donor mus med intraperitoneal injeksjon av ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg).
- Etter sikre tilstrekkelig anestesi, plasserer donor mus under operativsystemet mikroskop på X8-30 forstørrelse på et brett i ryggleie, og bruke Jod Prep Pad og alkohol Prep Pad for brystveggen forberedelse.
- Incise fremre brystveggen gjennom ribbeina og mellomgulvet å avsløre hjertet.
- Åpne høyre atrium, injisere 10 ml heparin-behandlet (100 E / ml) saltoppløsning i venstre ventrikkel for å spyle mus ved anvendelse av en 10 ml sprøyte med en 25-gauge nål.
- Resect hjertet og lungene til å eksponere hele lengden av torakal aorta.
- Dissekere thorakalaorta nøye for å minimere direkte traumer, while identifisere, ligate og dele trelast grener med 11-0 sutur nær aorta.
- Når thorakalaorta er fri fra omkringliggende vev, avgiftsdirektoratet hele thorakalaorta for transplantasjon.
- Skyll den avskårne enden av donor aorta med heparinisert (100 U / ml) saltvannsoppløsning, og lagre den i samme løsning på is (opp til 6 timer) før transplantasjon.
2. Mottaker Prosedyre
- Injisere mottaker mus med ip ketoprofen (5 mg / kg) for smertelindring, og thenanesthetize musene med ip ketamin (50 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Mottakeren mus er dypt bedøvet innen 10 minutter for en varighet på 60-90 min. Under operasjonen, er nivået av anestesi vurderes hvert 15 min ved å knipe den fremre bukveggen eller fot med tang. Hvis dyret reagerer på skadelige stimuli når som helst under operasjonen, vil en ekstra dose ketamin og xylazin (1/4 eller 1/3 opprinnelige dose) gis som sc eller im
- Etter sikre tilstrekkelig anestesi, barbere av pelsen i fremre bukveggen ved hjelp av en elektrisk barbermaskin, rengjør huden ved hjelp av jod Prep Pad og alkohol Prep Pad, dekker øynene med ophthalmic salve. Under operasjonen, vil følgende aseptisk teknikk brukes for operasjoner, inkludert rengjøring operasjonsbordet med 10% blekemiddel, iført sterile hansker og bruker sterilisert mikrokirurgi instrumenter (steam-steriliserte instrumenter for starten av operasjonen, deretter varmt glass perle-sterilisert instrumenter mellom flere operasjoner, etc).
- Plasser mottaker-mus under operativsystemet mikroskop med en forstørrelse på X8-30 på et brett i en liggende stilling.
- Incise bukveggen ved midtlinjen fra xyphoid til pubis, og spre bukveggen fra hverandre ved hjelp av en mikro-retractor å eksponere bukhulen.
- Trekke tarmen overlegent og pakk med gasbind fuktet med saltvann. Mottakeren mus blir kjølt ved tap av heat gjennom eksternaliserte tarmen. Det er viktig å opprettholde dyr varme. Imidlertid blir oppvarmingen brettet ikke brukes under operasjonen som beskjeden hypotermi er av nytte for å hindre spinal skade i løpet av okklusjon av aorta-blodstrøm så vel som det er lite effektiv varmeoverføring med fraværende blodtilførsel til den nedre halvdel av kroppen mus.
- Flytt den reproduktive organer inferiorly, vikle underliv områder av mottakerlandene mus med saltvann-løsning fuktet gasbind, og bruke den til å trekke endetarmen til høyre side av magen. De eksponerte vev er vannes jevnlig med saltløsning under transplantasjon.
- Dissekere rett ut et segment av infrarenal aorta mellom renal fartøy proksimalt og aortabifurkasjonen distalt og skille fra mindreverdige vena cava (IVC) nøye.
- Identifisere og ligate alle de små grenene som stammer fra dette segmentet av abdominal aorta bruke 11-0 polyamid Monofilament sutur.
- Cross-klemme den isolerte delen av enbdominal aorta ved hjelp av to vaskulære klemmer proximately 5 mm fra hverandre, en i hver ende.
- Transekt abdominal aorta mellom klemmene med skarpe mikro-saks til å lage Anastomotisk nettsteder.
- Resect et lite segment av abdominal aorta (opp til 0,4 mm i lengde) fra den ene avkuttede enden av transektert mottaker aorta for å gi plass til donor pulsåretransplantasjonen.
- Skyll aorta segmenter mellom klemmer med heparinisert saltoppløsning for å fjerne rester av blod. Aorta segmenter mellom klemmene og donor pulsåretransplantasjonen er vannet periodisk med heparinisert (100 U / ml), saltoppløsning (opptil 40 ml / kg) i løpet av anastomose.
- Tversgående begge sider av donor aorta med skarpe mikro-saks for å skape et segment pode på 2,5 mm i lengde for transplantasjon.
- Plasser donor pulsåretransplantasjonen i orthotopic stilling, anastomoserer donor pode sin proksimale og distale ende til mottakerens proksimale og distale avkuttede enden av abdominale aorta, henholdsvis, med en slutt-to-end mønster ved hjelp 11-0 polyamid Monofilament sutur.
- For de kontinuerlige sting, plassere opphold sting på tre og ni posisjoner først. Mellom to stay sting på hver side av pode, anastomoserer begge Snittflatene i 3-4 sting med de løpende sting, og knytte de kjører sting å bo sting med dobbel knute. Siden begge lag av nedleggelse er kontinuerlige, er risikoen for dehiscence økt. Donor pulsåretransplantasjonen skal være i passende lengde for å koble mottakerens proksimale og distale avskårne enden av abdominal aorta.
- For de avbrutte sting, konstruere fire anastomose på tre og ni stillinger i begge sider av pode det første, og anastomoserer begge kuttet kantene i 3-4 masker mellom to opphold sting på hver side av pode.
- Slipp distale klemme slik at retrograd strømme inn pode, identifisere blødning nettsteder og foreta flere sting i 3 minutter.
- Etter konstatere tilfredsstillende hemostase, slipper den proksimale klemme.
- Bekreft pode åpenheten ved nærvær av sterk pulsasjon i transplantatet og tilstøtende den proksimale segment av innfødt abdominale aorta, spesielt i den distale tilstøtende segment av abdominal aorta og nedre mesenterisk arterie. Betrakt trombose i anastomotisk områder hvis pulseringen avta i løpet av noen få minutter etter gjenopprettelse av blodstrømmen.
- Tilbake tarmen inn i bukhulen.
- Sy lukke bukveggen med 5-0 nylon sutur i muskel lag og hudlaget, henholdsvis.
- Plasser mottaker-mus til et rent bur på toppen av en varmepute, og vente 1-2 t for musene for å gjenvinne bevisstheten og komme seg fra anestesi. Det er viktig å opprettholde dyr tilstrekkelig varme under utvinning. Hold mus i det varme og tørre buret før dyret våkner av narkosen.
- Vurdere motorisk funksjon av bakben etter mus utvinning, og igjen på den andre dagen. En vellykket transplantasjon kirurgi vil bli bekreftet if ingen dysfunksjon av bakben er observert i mottaker-mus på den andre dagen.
- Administrer-mottaker-mus med Ketoprofen i drikkevann (5 mg / kg / d = 27 ug / ml i drikkevann) i 48 timer. Dersom mottaker mus lider av smerter unrelieved av postoperative analgetika som gjenspeiles av tap av mobilitet, unnlatelse av å stelle, unormal bunched holdning, etc, vil de avlives. Dyrene skal avlives på forhåndsdefinerte endepunktene etter 1-60 dager.
Graft analyse
Arterie grafts i allograft ble anskaffet på fire uker og grafts i syngen pode modell var 6 uker postoperativt (5 uker etter virusinfeksjon) og analysert av standard histologiske teknikker for Elastica-van Gieson (EVG) flekker, hematoxylin og eosin (HE) flekker og immunfluorescens farging. Bildene ble tatt ved hjelp av en immunfluorescens mikroskop system (Zeiss). Celletellingen kjerner omgitt av positive farging var utføreed under høyt forstørrelse og i gjennomsnitt fra 5 tverrsnitt for hver pode. De podete området målinger av hulrommet (innen endotelium), intima (mellom endotel og indre elastiske lamina, IEL), medium (mellom IEL og ytre elastiske lamina, ål), vegg-tykkelse (mellom endotel og ytre elastiske lamina) og hele fartøy (innenfor CRI) ble beregnet ut fra 5 serielle tverrsnitt, 150 mikrometer fra hverandre for hver pode, ved hjelp av dataassistert bildeanalyse og NIH Bilde 1,60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Statistisk analyse
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Tosidige, ble paret t tester og en to-veis ANOVA analyse utført ved hjelp av Prism program (GraphPad Software). Forskjeller med p <0,05 ble ansett å indikere statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus allograft arteriosklerose (GA) modell: I denne modellen er en mannlig donor aorta transplantert inn kvinnelige mottaker, slik at det vert induserer alloreactive T celle-medierte alloimmun respons mot en mindreårig Y antigen (den mannlige-spesifikke mindre histocompatibility antigen HY) uttrykt på transplantatet 12, og i sin tur T-celle-produsert IFN-γ stasjoner VSMC proliferasjon 20 som observert i andre allograft transplantasjon modeller 2, 6, 8-10, 14.. Et segment av thorakalaorta fra en donor mann ble kirurgisk interposed inn en abdominal aorta av en kvinnelig mottaker, og aortas ble høstet ved fire uker etter transplantasjon (figur 1A). Histologisk analyse av arterie grafts ble utført av Elastica-van Gieson (EVG), H & E og farging med VSMC markør SMA og pan-leukocytter markør CD45. Ingen transplantatavstøtning ble observert mellom C57BL/6J hannmus i aorta transplantasjon. Hann til hunn transplantation indusert GA, karakterisert ved infiltrasjon av leukocytter og neointima formasjon med opphopning av VSMC (figur 1B). For å finne ut hvilken rolle av IFN-γ signalering i GA, aortas fra WT eller IFN-γR-KO mus ble transplantert til WT kvinnelige mottaker. Sletting av IFN-γR i donor grafts viste en redusert infiltrasjon av leukocytter og neointima formasjon med nedgang på SMA-positive celler sammenlignet med WT (ikke vist). Disse resultatene støtter en viktig rolle for IFN-γ signalering i GA progresjon som tidligere observert i mus xenograft humanisert transplantasjon 4. modell, 15, 17, 18.
IFN-γ-indusert pode arteriosklerose: Det har blitt fastslått at IFN-γalone er tilstrekkelig til å indusere neointima dannelse i en humanisert musemodell GA 15 modell, 17.. Her har vi etablert en IFN-γ-mediert mus syngen pode arteriosklerose modell. I denne modellen ble WT mannlige aortas transplanterti IFN-γR-mangelfull mottaker mus etterfulgt av intravenøst injeksjon av replikering-mangelfull adenovirus som koder for mus IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ) eller kontroll LacZ genet (Ad-LacZ) (Figur 2A). Nedsatt infeksjon og lever transgene uttrykk for Ad-LacZ ble verifisert av X-gal flekker i Ad-LacZ gruppen, men ikke de Ad-IFN-γ grupper som beskrevet tidligere 17. Systemisk ekspresjon av IFN-γ i serum ble påvist ved et nivå på 120-150 ng / ml på dag 3 og beholdt opptil 5 uker i Ad-IFN-γ men ikke i LacZ-gruppen. Aortas ble høstet på fem uker etter injeksjon av adenovirus for histologisk analyse og morfometrisk vurdering av arterien pode intima, media, lumen og fartøy området. Ekspresjon av IFN-γ, men ikke LacZ kontroll, indusert neointimal dannelse. Ingen åpenbar infiltrasjon av leukocytter ble detektert sammenlignet med allograft-modellen (figur 2B). Disse dataene er konsistent med tidligereobservasjoner i humanisert mus xenograft modell som IFN-γ alene er tilstrekkelig til å indusere neointima formasjon 15, 17.
Figur 1. Illustrasjon og ordningen med musen allograft arterie transplantasjon modell. A. En illustrasjon av allograft transplantasjon prosedyren. Et segment av mannlig donor torakal aorta ble kirurgisk innsatt i abdominal aorta i en kvinnelig mottager. Aortas ble høstet ved fire uker etter transplantasjon. Som en kontroll ble et segment av mannlig donor thorakalaorta kirurgisk anbrakt inn i en abdominal aorta i en mannlig mottager. B. Histologisk analyse av arterie grafts av Elastica-van Gieson (EVG), H & E og farging med anti-a-SMA og anti-CD45. Representative photomicrographs vises. Pilspisser markere den interne elastiske lamina å avgrense intima fra media. Scalebar: 50 mm. Ingen pode arteriosklerose ble observert i hann til hann gruppen.
Figur 2. IFN-γ-indusert mus syngene arterie transplantasjon modell. A. En ordningen av IFN-γ-indusert mus syngene modell. Mann donor thorax arterie ble dissekert og transplantert inn abdominal aorta hos mannlige mottaker IFN-γR KO mus. En uke etter operasjonen, ble 1X10 9 PFU Ad-mIFN-γ eller Ad-LacZ injisert i mottakerlandene mus via halsvene. Serum ble oppsamlet på dag 3, 7 og 35 etter injeksjon av virus for IFN-γ måling. Grafts ble høstet seks uker for morfometrisk vurdering. B. Histologisk analyse av arterie grafts ved farging med anti-A-SMA-og anti-CD45. Representative photomicrographs vises. Pilspisser markere den interne elastiske lamina å avgrense intima fra media. Scale bar: 50 mm. Ingen pode arteriosklerose ble observert i LacZ-gruppen.
| Trinn | Problem | Mulig årsak | Oppløsning |
| 2.17 | Alvorlig blødning | Gapet (avstanden mellom to masker) er for stor, særlig av avbrutte suturer. | Avstanden mellom hver to masker skal være ensartet under anastomose. Legg ett sting blødende stedet. |
| Bare adventitia er sydd. | Identifisere og sy hele aorta | ||
| Unligated trelast grener | Ligating trelast grener | ||
| Bruker for mye heparin | Med opptil fire0 ml / kg heparin-behandlet (100 U / ml), saltoppløsning for å vanne operasjonen feltet i løpet av anastomose. | ||
| 2,19 | Trombose | Lumen er for smalt på anastomotisk område, spesielt av kontinuerlige suturer. | Unngå anastomering for mange aorta på hver maske. Aorta størrelse på mus er meget liten. Å sy for mange aorta under anastomose vil føre lumen smal og trombose, men vil til stingene for mindre aorta føre til alvorlig blødning. |
| Sutur pasning gjennom aorta veggen på motsatt side. | Identifisere aorta og deretter lage masker. Hvis det har skjedd, bør operatøren avskåret sutur knop og re-sting på dette nettstedet. | ||
| Endotelceller blir skadet under anastomose. | Bruke opphold sting for anastomose. Ikke hold / klem hele arotic veggen ved forsteinsopp for anastomose. | ||
| Heparin er ikke brukt under anastomose. | Aorta størrelse på mus er meget liten. Det er veldig lett for trombose dannelse i grafts etter anastomose. Å gi heparin å vanne operasjonen feltet er svært viktig for å redusere trombose. Suksessrate på fartøy transplantasjon hos mus er rundt 50% uten å bruke heparin og 95-100% med hjelp av heparin. Dersom trombose blir funnet i løpet av få minutter etter gjenopprettelse av blodstrømmen, en alternativ tilnærming for å fjerne trombose er å injisere 30-50 ul heparinied saltoppløsning (100 E / ml) gjennom IVC. Ikke injiserer for mye heparin bare i tilfelle av alvorlig blødning. | ||
| 2.23 | Transplantasjon mislyktes | Forsinket blødning og trombose, eller andre | Fartøyet transplantasjon i mus er meget vanskelig operasjon for aorta størrelsen av mus er meget liten. Det er tre viktige points for den vellykkede operasjonen: 1) sørge aorta vegger av vert og donor er anastomoseres sammen uten åpenbart gap, bare i tilfelle av alvorlig blødning, 2) holder nok lumen plass på anastomotisk området, bare i tilfelle av trombose, 3) bruke heparin på en riktig dose i løpet av anastomose, bare i tilfelle av trombose og alvorlig blødning. Etter denne protokollen, er suksessraten for forfatteren mer enn 95%. |
Tabell 1. Feilsøking tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beskrevne protokoller er fokusert på mus GA-modeller. Prosedyrene kan anvendes for andre pode transplantasjonsformål modeller. Disse modellene inkluderer humanisert xenograft (dvs. menneskelige koronar segmenter innskutt i infra-renal aorta av immunsvikt mus) og akutt avvisning mus GA-modellen (dvs. en mus aorta fra en genetisk sil over i en annen genetisk belastning mottaker). Våre beskrevet mus modeller er mer å lukke menneskelige GA lesjoner. Den første modellen involverer interposition av et fartøy segment fra en hann mus i en kvinnelig mottager av den samme innavlet stamme (C57BL/6J). Transplantatavstøtning i dette tilfellet er rettet kun mot mindre histocompatibility antigener kodet av Y-kromosom (tilstede i den mannlige men ikke den hunn) og den avvisende reaksjon som følger er tilstrekkelig lat for å bevare donor-deriverte glatte muskelceller i flere uker 2, 6 , 8-10, 12, 14. Den andre modellen innebærer interposing en arterie segment fra en villtype C57BL/6J mus donor i en vert mus av samme stamme og kjønn som mangler reseptoren for IFN-γ (IFN-γR-KO) etterfulgt av administrering av mus-IFN γ (levert via infeksjon i mus liver med en adenoviral vektor.) Det er ingen avvisning i dette tilfelle både som giver-og mottaker-mus er av samme stamme og kjønn, men donor glatte muskelceller spre seg i respons på cytokin mens verts-avledede celler, mangler reseptor for dette cytokin, reagerer ikke 21. Videre, ved å tilbakekryssing flere genetiske endringer inn i beholderen donor, kan begge modellene brukes for å vurdere effekten av spesifikke gener på IFN-γ-drevet glattmuskelcelleproliferasjon og GA progresjon.
Rollen til IFN-γ i mus GA modeller er ikke blitt godt etablert. Våre to musemodeller har bekreftet rollen som IFN-γ i mus GA. I den første modell, blir en mannlig donor aorta transplantert inn i hunn mottakerslik at det vert induserer alloreactive T celle-medierte alloimmun reaksjoner mot den mannlige-spesifikke mindre histocompatibility antigen HY uttrykt på grafts 12. Faktisk, WT (C57BL/6J) hann til C57BL/6J kvinnelige transplantasjon indusert GA, karakterisert ved infiltrasjon av leukocytter og neointima formasjon med VSMC opphopning. I kontrast, betyr hann til hann aorta transplantasjon ikke fremkalles GA. Vi er fast bestemt rolle IFN-γ signalering i vaskulære celler ved hjelp av IFN-γR-KO som donor pode transplantert til WT kvinnelige mottaker. Sletting av IFN-γR i donor grafts avstumpet leukocyttinfiltrasjon og VSMC opphopning i neointima. Derfor, er rollen til IFN-γ i nåværende musemodell konsistent med den humaniserte mus xenograft modell transplantasjon hvor IFN-γ signalering i pode er kritisk for GA progresjon 4, 15, 17, 18. Vi har bestemt om IFN-γ alene er tilstrekkelig til å indusere neointima dannelse ved å skape en IFN-γ-medirerte mus syngen pode arteriosklerose modell. I denne modellen er en mannlig aorta transplantert inn en mannlig IFN-γR-KO mottakeren dyr som mus IFN-γ er da systemisk uttrykt av intravenøst injeksjon av replikering-mangelfull adenovirus som koder for mus IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ ). Vi observerte at ekspresjon av IFN-γ, men ikke LacZ kontroll, indusert neointimal dannelse. I denne modellen er ingen tydelig infiltrasjon av leukocytter detektert sammenlignet med allograft-modellen, i samsvar med tidligere observasjoner i en menneskelig arterie-SCID mus transplantasjon modell der vaskulær IFN-γ signalering alene er tilstrekkelig til å indusere neointima dannelse i fravær av leukocytter 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend R01 HL109420 til WM og AHA 9320033N til LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
