Beoordeling van de maaglediging in niet-obese diabetische muizen met behulp van een [¹³ C]-octaanzuur ademtest

Summary

Bepaling van maaglediging Niet-invasieve [¹³ C]-octaanzuur ademtest voor het opsporen van gastroparese bij vrouwelijke NOD LTJ muizen.

Abstract

Maaglediging studies in muizen zijn beperkt door het onvermogen om maaglediging veranderingen in hetzelfde dier te volgen aangezien de meest gebruikte technieken vereisen doden van de dieren en postmortem herstel van de maaltijd ^1,2. Deze aanpak voorkomt dat longitudinale studies om te bepalen veranderingen in de maaglediging met de leeftijd en de progressie van de ziekte. De meest gebruikte ^[13 C]-octaanzuur ademtest voor mens ³ is aangepast voor gebruik in muizen ratten ^4-6 en ⁷ en we eerder aangetoond dat deze test betrouwbaar en reageren op veranderingen in maaglediging in respons op geneesmiddelen en tijdens diabetes progressie ^8. In deze video presentatie van het beginsel en de praktische uitvoering van deze gewijzigde test wordt uitgelegd. Evenals in de vorige studie worden NOD LTJ muizen gebruikt, een model van type 1 diabetes ^9. Een deel van deze muizen ontwikkelen symptomen van gastroparese, een complicatie van diabetes gekenmerkt door vertraagde maaglediging zonder mechanische obstructie van de maag ^10.

Dit document laat zien hoe de muizen trainen voor het testen, hoe de test maaltijd te bereiden en het verkrijgen van 4 uur maaglediging data en hoe de verkregen gegevens te analyseren. De koolstofisotopen analyzer gebruikt in de onderhavige studie is geschikt voor de automatische monstername van de luchtmonsters tot wel 12 muizen op hetzelfde moment. Deze techniek maakt de longitudinale opvolging van maaglediging van grotere groepen van muizen met diabetes of andere langdurige ziekten.

Introduction

Deze publicatie beschrijft de technische en methodologische overwegingen betrokken zijn bij niet-invasieve meting van maaglediging bij muizen. Door het volgen van het protocol hier beschreven, onderzoekers kunnen betrouwbaar en reproduceerbaar veranderingen in de maaglediging als gevolg van de ontwikkeling van de ziekte te volgen, vooral de invloed van farmacologische middelen op de maaglediging en volg de respons van de maaglediging op de behandeling van een ziekte of gebreken ^{6,8, 11,12.} In eerdere publicaties de toepassing ^van 13C octaanzuur ademtesten bleek een nuttige manier meten maaglediging bij mensen en dieren ^3,8 zijn. Dit document beschrijft in detail de procedures die nodig zijn om betrouwbare gegevens te verkrijgen over de 6 tot 8 maanden nodig zijn voor een longitudinale studie van de maaglediging bij muizen met diabetes. De voordelen van deze volgende protocol vergeleken met eerder gepubliceerde methoden zijn dat de onderzoeker kan de data obtaine verzekerdd zal zijn betrouwbaar en reproduceerbaar. Bovendien het automatische systeem voor het verzamelen en analyseren van de gasmonsters hier beschreven verhoogt het aantal dieren dat tegelijk kan worden gevolgd in een studie. Over het geheel genomen het doel van deze paper is het identificeren van de belangrijkste factoren die gewenning van de muizen op de proef en dat de variabiliteit te verminderen in de verkregen resultaten te handhaven.

Voor de in vivo meting van maaglediging, worden muizen overnacht gevast en in de transparante plastic testkamers met constante luchtstroom. Na de muizen krijgen gewend aan de buizen, basislijn uitgeademde ¹³ CO _2-gehalte wordt bepaald en luchtstroom overeenkomstig aangepast. Vervolgens beheren wij een testmaaltijd bestaande uit eidooier gemengd met ¹³ C-gelabelde octaanzuur. Omdat de muizen gevast en getraind, zij over het algemeen eten de testmaaltijd binnen 2 minuten. De toegediende octaanzuur niet wordt geabsorbeerd in de maag, maar wordt opgenomen in het duodenum eend krijgt in de lever in ¹³ CO ₂ uitgezonden en uitgeademd, waardoor een verrijking van ¹³ CO ₂ in de omgevingslucht. Luchtmonsters worden verzameld op bepaalde tijdstippen en geanalyseerd door de koolstofisotoop analyzer. De snelheidsbepalende stap in dit proces is maaglediging en de pulmonale uitscheiding van ¹³ CO ₂ direct overeenkomt met maaglediging van het gelabelde maaltijd.

Figuur 1. Schema van maaglediging inrichting. Na een nacht vasten, worden muizen geplaatst in transparante kamers waardoor ze te bewegen en vrij kunnen draaien. Een inlaatbuis kan frisse lucht en constante stroom en een uitlaat leidt tot het isotoop analyzer het meten van de ^{13 C-to-12}C verhouding in de uitgeademde lucht. De kamer heeft ook een centrale poort voor de voedselproducten met ^{[13C]-octaanzuur.}

Protocol

1. Training en gewenning van de muizen Vóór analyse zet alle muizen in de testkamers voor 2-4 uur met constant debiet om ze wennen aan de testomstandigheden. Dit vermindert aanzienlijk stress die anders zouden kunnen leiden dat afwijkende detectie van vertraagde maaglediging. Behandel de muizen op dezelfde wijze als de maaglediging experiment werd uitgevoerd. Bereid eidooier (zie verder) zonder toevoeging octaanzuur en voeden 0,2 g aan elke muis. Herhaal dit proces totdat de muizen voldoende schol…

Representative Results

Een representatieve gegevensreeks uit drie verschillende muizen wordt weergegeven in figuur 2. De zwarte grafiek geeft de datapunten van een muis met normale maaglediging. Het toont de fractie van 13 C die wordt teruggewonnen in de uitgeademde lucht, uitgedrukt als een percentage van de toegediende dosis per uur uitgedrukt als een functie van tijd. De blauwe curve is van een muis met een versnelde maaglediging met een T half waarde van 40 min en de rode curve is van een muis met een vertraagd…

Discussion

De beschreven techniek maakt hierin voor herhaalde of niet-invasieve in vivo meting van vaste maaglediging in muizen. Dit systeem heeft het voordeel dat de dieren niet beperkt in de meetkamer, zodat ze bewegen en vrij kunnen draaien. Aangezien dit een onbekende omgeving, de muizen moeten nog worden opgeleid en gewend aan het testen kamers om de effecten van stress te voorkomen op de maaglediging. In het algemeen we aannemen dat de maaglediging data betrouwbaar is als de intra-muis variabiliteit tussen opeenvolg…

Materials

NAME	COMPANY	CAT NUMBER	COMMENTS
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)