إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري
Summary
يوصف أسلوب لتجميع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان في غرفة الفحص المجهري لدراسات الهجرة حية الخلية. هندسيا يجمع بين البيئة والسطوح المانعة لاصقة المسارات مع التدرجات الحل وبالتالي يسمح احد لتحديد الأهمية النسبية للمنبهات التوجيه.
Abstract
يمكن الشعور الخلايا وتهاجر نحو تركيزات أعلى من العظة لاصقة مثل البروتينات السكرية من المصفوفة خارج الخلية والعظة للذوبان مثل عوامل النمو. هنا، ونحن الخطوط العريضة لطريقة لإنشاء تدرجات لاصقة معارضة من العظة وقابل للذوبان في غرفة ميكروفلويديك، والذي يتوافق مع الخلية الحية التصوير. ويعمل A كوبوليمر من بولي-L-يسين والبولي ايثيلين جلايكول (PEG-PLL) إيقاف فاعلية coverslips الزجاج ومنع غير محددة امتزاز الجزيئات الحيوية والخلايا. وتستخدم الطباعة microcontact المقبل، أو الطباعة الحجرية تراجع القلم لخلق مسارات streptavidin على السطوح تخميلها لتكون بمثابة نقطة لرسو الببتيد المعقدة البيروكسيديز أرجينين حمض الأسبارتيك، جليكاين (RGD) كما جديلة لاصقة. يتم وضع الجهاز على سطح ميكروفلويديك تعديل واستخدامها لإنشاء الانحدار من العظة لاصقة (100٪ RGD لRGD 0٪) على المسارين streptavidin. وأخيرا، يتم استخدام نفس الجهاز ميكروفلويديك لإنشاء معامل ليمث جاذب كيميائيح ومصل بقري جنيني (FBS)، كما جديلة للذوبان في الاتجاه المعاكس من التدرج من العظة لاصقة.
Introduction
توجه الهجرة الخلية هو خاصية أساسية من العديد من الخلايا وهو أحد الجوانب الرئيسية لكثير من العمليات الفسيولوجية العادية، بما في ذلك التطور الجنيني، والدفاع ضد العدوى والتئام الجروح. وبالإضافة إلى ذلك، والهجرة الخلية كما تلعب دورا بارزا في كثير من الأمراض مثل أمراض الأوعية الدموية، ورم خبيث الخلايا المزمن والتهاب 1،2. في حين أن الولايات الكلاسيكية للهجرة الخلية – الاستقطاب والإرشاد بروز وتشكيل التصاق، وتوليد القوة وتراجع الخلفية – والمقبولة عموما 3،4، كان الكشف عن آليات الزمانية المكانية التي يتم من خلالها تنسيق التكامل إشارة أكثر تحديا.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) بمثابة الركيزة للالتصاق الخلية، ومن خلال الكيميائية الكامنة 5 و المادية التنوع 6، يقدم العظة الاتجاه للملاحة الخلية 7،8. وبالإضافة إلى هذه العظة لاصقة 9، العوامل القابلة للذوبان 10-12 </ سوب> مثل كيموكينات وعوامل النمو يمكن أن تحدث الموجهة الهجرة الخلية من خلال مستقبلات الإشارات الخاصة بهم وجاذب كيميائي motogenic المصب. حاليا، من غير المعروف ما إذا كان يشير من خلال المشاركة ومستقبلات الالتصاق (أي integrins) أو مستقبلات جاذب كيميائي، مثل مستقبلات التيروزين كيناز (RTK)، هي المهيمنة. ولا هو يعرف ما إذا كان التسلسل الهرمي للأنظمة هي مستقبلات معينة من الخلايا النوع.
الحية المجهري خلية يعطي ثروة من المعلومات التي لا يمكن الوصول إليها في معظم المقايسات ويمكن دمجها مع أجهزة ميكروفلويديك لتوليد تدرجات من ثبتوا العظة وقابل للذوبان 13،14 15 16. الطريقة الموضحة هنا يستخدم سلسلة من الخطوات البسيطة، وأنشأ لتعديل السطح جنبا إلى جنب مع غرفة لميكروفلويديك المتاحة تجاريا لإنشاء فحص التصوير للهجرة الخلية التي يمكن بسهولة أن تنفذ في مختبر البيولوجيا خلية (الشكل 1). وتجميعهاالجهاز ميكروفلويديك والصفات البصرية التي يمكن مقارنتها على الزجاج (17) والتدرجات من الجزيئات إنتشاري مستقرة للا يقل عن 16 ساعة. ويمكن استخدام هذا النظام لتقنيات المجهر epifluorescence والمتقدمة. على عكس غيرها من الاجهزة الكيميائي 18، هذا النظام هو مناسبة لتسجيل المهاجرة ببطء، والخلايا الملتصقة. الأهم من ذلك أن النظام هو وحدات ويسمح بسهولة إدخال بديلة أو لاصقة قابلة للذوبان العظة الهجرة وفحص أنواع الخلايا المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا (لزجة-3D من الشرائح الانجذاب الكيميائي Ibidi) لدراسة آثار السطوح معدلة كيميائيا والتدرجات جاذب كيميائي على الهجرة الخلية. هذا الإعداد ميكروفلويديك لا يتطلب تدفق لأن يتم تأسيس التدرج عن طريق الانتشار ع?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يعترف بتمويل من مجلس البحوث الوطني الاسترالي والصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا وأود أيضا أن أشكر مرفق التصنيع الوطنية الأسترالية للسيد SU-8 لطباعة microcontact. ويدعم SHN من قبل وزارة التعليم العالي وماليزيا يونيفرسيتي سينز ماليزيا.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
- Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
- Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).
- Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).
- Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).
- Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
- Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
- Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
- Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
- Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).
- Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
- Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
- Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
- Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
- Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
- Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
- Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
- Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).
