Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.
Abstract
Zellen können zu erfassen und zu höheren Konzentrationen an Klebstoff Zeitgeber wie die Glycoproteine der extrazellulären Matrix und löslichen Cues wie Wachstumsfaktoren migrieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur gegenüberliegenden Gradienten aus Klebstoff und löslichen Signale in einem Mikrofluidik-Kammer, die mit lebenden Zellen zu schaffen. Ein Copolymer aus Poly-L-Lysin und Polyethylenglykol (PEG-PLL) wird eingesetzt, um Glasdeckgläser passivieren und verhindern eine unspezifische Adsorption von Biomolekülen und Zellen. Weiter, Mikrokontaktdrucken oder Dip-Pen-Lithographie verwendet werden, um Spuren von Streptavidin an den passivierten Oberflächen zu schaffen, um so Verankerungspunkte für das biotinylierte Peptid Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) als klebende Cue dienen. Mikrofluidische Vorrichtung wird auf die modifizierte Oberfläche platziert und verwendet, um den Gradienten des Klebstoffs Queues (100% bis 0% RGD RGD) an den Streptavidin Spuren zu erzeugen. Schließlich wird der gleichen mikrofluidischen Vorrichtung verwendet, um einen Gradienten eines chemoattraktiven erfolg erstellenh wie fötalem Rinderserum (FBS), wie die lösliche Cue in der entgegengesetzten Richtung des Gradienten aus Klebstoff Signale.
Introduction
Regie Zellwanderung ist eine grundlegende Eigenschaft von vielen Zellen und ist ein wichtiger Aspekt von vielen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Infektabwehr und Wundheilung. Zusätzlich Zellwanderung spielt auch eine wichtige Rolle bei vielen Krankheiten wie Gefäßerkrankung, Tumorzellenmetastase und chronischen Entzündungen 1,2. Während die klassischen Zuständen der Zellwanderung – Polarisation Vorsprung Erweiterung, Bildung Haftung, Krafterzeugung und hinten Rückzug – in der Regel 3,4 angenommen werden, hat die Aufklärung der raumzeitlichen Mechanismen, durch die Signal-Integration koordiniert wurde schwieriger.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient als Substrat für die Zelladhäsion und durch inhärente chemische und physikalische 5 6 Vielfalt stellt Richtungshinweise für Zellennavigationsmodus 7,8. Neben diesen Klebstoff Cues 9, lösliche Faktoren 10-12 </ Sup>, wie Chemokine und Wachstumsfaktoren können induzieren gerichteten Zellmigration durch chemoattraktive Rezeptoren und deren stromabwärts motogenic Signalisierung. Derzeit ist es nicht bekannt, ob Eingriff und Signalisierung durch Adhäsionsrezeptoren (dh Integrine) oder chemoattraktive Rezeptoren, wie Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), dominant sind. Auch ist es nicht bekannt, ob Hierarchien von Rezeptor-Systeme Zelltyp spezifisch sind.
Live-Mikroskopie bietet eine Fülle von Informationen, die nicht zugänglich ist lose Assays und kann mit mikrofluidischen Bauteilen kombiniert werden, um Steigungen von immobilisierten 13,14 und löslichen Cues 15 16 zu generieren. Das hier beschriebene Verfahren verwendet eine Reihe von einfachen und bewährten Schritte zur Oberflächenmodifizierung in Verbindung mit einem handelsüblichen Mikrofluidik-Kammer, eine Abbildungsanordnung Assay für Zellmigration, dass leicht in einer Zelle Biologielaboranten (Abbildung 1) implementiert werden erstellen. Die zusammengebauteMikrofluidikvorrichtung besitzt optische Eigenschaften, die vergleichbar mit Glas und 17 sind die Steigungen der diffundierbare Moleküle sind für mindestens 16 Stunden stabil. Das System kann für Epifluoreszenz-Mikroskopie und fortschrittliche Techniken verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Chemotaxis Setups 18, eignet sich dieses System zum Aufzeichnen langsam wandernden, adhärenten Zellen. Wichtig ist, ist das System modular aufgebaut und leicht ermöglicht die Einführung alternativer Kleber oder lösliche Migration Signale und Prüfung verschiedener Zelltypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei diesem Protokoll, verwendeten wir ein handelsübliches Mikrofluidvorrichtung (Slide-klebrigen Chemotaxis 3D von Ibidi), um die Effekte von chemisch modifizierten Oberflächen und chemoattraktive Gradienten auf Zellmigration studieren. Diese mikrofluidischen Einrichtung erfordert keine Strömung, da der Gradient durch Diffusion entlang der Länge des Kanals einstellt. Dies ist wichtig, weil Flow unterschiedlich beeinflussen könnte langsam wandernden Zellen wie Fibroblasten, die stabil fokalen Adhäsionen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Mittel aus dem Australian Research Council und National Health and Medical Research Council of Australia und auch möchte ich danke Australian National Fabrication Facility für die SU-8-Master für das Mikrokontaktdruck. SHN wird durch das Ministerium für Höhere Bildung Malaysia und Universiti Sains Malaysia unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
References
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