Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em> Arabidopsis thaliana</em> Frø

Summary

Vi rapporterer en effektiv og enkel metode til at isolere embryoner i de tidlige stadier af udvikling fra<em> Arabidopsis thaliana</em> Frø. Op til 40 embryoner kan isoleres i 1 time til 4 timer, afhængigt af den efterfølgende anvendelse. Proceduren er egnet til transkriptom, DNA-methylering, reporter-genekspression, immunfarvning og fluorescens<em> In situ</em> Hybridiserings analyser.

Abstract

I blomstrende planter, udvikler fosteret inden for en nærende væv – endosperm – omgivet af de maternelle frø hinderne (eller frøskal). Som en konsekvens heraf er isolation af plante embryoner i de tidlige faser (1 celle til kugleformede etape) teknisk udfordrende på grund af deres relative utilgængelighed. Effektiv manuel dissektion på tidlige stadier er stærkt svækket af den lille størrelse af unge Arabidopsis frø og klæbeevne af foster til det omgivende væv. Her beskriver vi en metode, der giver en effektiv isolering af unge Arabidopsis embryoner, hvilket gav op til 40 embryoner i 1 time til 4 timer, afhængigt af den efterfølgende anvendelse. Fostre, der frigives i isolation buffer med lidt knusning 250-750 frø med en plastik pistil i en Eppendorf rør. Et glas microcapillary tilknytning til enten en standard laboratoriepipette (via en gummislange) eller en hydraulisk styret microinjector bruges til at indsamle embryoner fra dråber stedd på en multi-godt slide på en inverteret lysmikroskop. De nødvendige tekniske færdigheder er enkel og let omsættelige, og den grundlæggende opsætning ikke kræver dyrt udstyr. Embryoner indsamlet er egnet til en lang række efterfølgende anvendelser, såsom RT-PCR, RNA-sekventering, methylering af DNA analyser, fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunfarvning, og reportergenassays.

Introduction

Embryo af blomstrende planter er omgivet af endosperm, en nærende væv afledt fra et andet befrugtning begivenhed. Både foster og endosperm er omgivet af flere cellelag i frøkappe. Kollektivt disse væv danner et frø, der udvikler inde i frugten. Således er vævs-og celle-specifikke analyser af Arabidopsis embryoner stærkt forringet grundet deres utilgængelighed. Ikke desto mindre, embryoer på det sene-kugleformede eller senere faser er forholdsvis godt modtagelig for manuel dissektion ved hjælp af fine wolfram nåle under stereomikroskop eller ved et let tryk på frøet ved hjælp af pincet til at udtrække dem. Sådanne teknikker succes blev anvendt til transcriptome eller epigenome profilering analyser, f.eks microarray hybridisering, bisulfit sekventering eller RNA-sekventering (fx ^1-3). I modsætning hertil er fortsat undersøgelser af embryoner på zygote til tidlig kugleformede stadie teknisk udfordrende. Til dato har kun få undersøgelser reported transkriptom analyser på unge embryoer ved hjælp af enten laser-capture mikrodissektion (LCM) af embryonale væv fra faste frø afsnit ⁴ eller manuel udvinding af individuelle embryoer fra inden frø ved hjælp af fine værktøjer ^5.. Men LCM udstyr ikke almindeligt tilgængelige og manuel embryo udsugning på tidlige stadier er tidskrævende og kræver gode dissektion færdigheder, som er ikke er let omsættelige. Ud over at genom-dækkende analyser findes på stedet genekspressionsanalyse også svært at udføre på unge, hel-mount embryoner fra Arabidopsis. Til en vis grad kan unge embryoer frigives mikroskopobjektglas ved let tryk på frøene og anvendes til reportergenassays eller protein detektion ved immunfarvning (se for eksempel ^6,7). Denne teknik er imidlertid ikke tillader high-throughput embryo isolation, hvilket hindrer kvantitative analyser.

Derfor har vi udviklet en effektiv og hurtig protokolfor tidlig embryo isoleret fra Arabidopsis frø, der er enkel at sætte op, let at overføre, og egnet til en bred vifte af downstream-applikationer. Det grundlæggende princip er at forsigtigt knuse frø – dissekeret fra unge siliques i et Eppendorf-rør ved hjælp af en plastik pistil i en egnet isolation buffer. Frøet ekstrakt anbringes i dråber på en multi-brønd sliden og screenet for tilstedeværelsen af ​​frigivne embryoner på det ønskede tidspunkt ved hjælp af en inverteret mikroskop. Embryonerne opsamles ved hjælp af et glas microcapillary knyttet til en microinjector eller en standard laboratorium pipette. For molekylære applikationer anvendes embryoner vaskes to gange ved gentagne udsætning i dråber af nye isolation buffer, før du overfører dem til destinationen buffer i et minimalt volumen. Til cytologiske applikationer (reporter assays, immunfarvning, FISH), kan vasketrin udelades.

Fremgangsmåden giver flere fordele: (i) det giver 25-40 embryoner i ~ 45 min til cytologisk apppublikationer eller i 3-4 hr til molekylær ansøgninger (inklusive vasketrinene), (ii) den giver mulighed isolering af specifikke fosterstadiet, (iii), er det nemt overføres til andre personer og laboratorier på grund af sin simple setup, (iv) kræver overkommelig udstyr til den grundlæggende opsætning, der er modtagelig for opgraderinger, og (v) det blev med held brugt til forskellige downstream-applikationer såsom RNA-sekventering ^8, gen-specifikke DNA-metyleringsanalyse ⁹ reporter assays ⁽¹⁰ og Raissig et al., i prep.) og FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux upubliceret se figur 5).

Protocol

Proceduren er sammenfattet i rutediagrammet i figur 1 viste. Den microcapillaries og instrumentopstilling er vist i figur 2 og figur 3, og de ​​typiske trin i embryo isolation er vist i fig. 4. 1.. Materiale og buffer Forberedelse 1,1 Silikonebeklædning af glas microcapillaries Placer microcapillaries i et 15 ml Falcon-rør med ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) og vend adskillige gange. …

Representative Results

Vores embryo isolation procedure (fig. 1) muliggør isolering af op til 40 embryoner i 4 timer, hvis Vaskene udføres, fx til molekylære anvendelser, eller i mindre end en time, hvis vaskninger udelades, fx til cytologiske applikationer. Figur 2 viser høj og lav kvalitet microcapillary tips og Figur 3 viser opsætningen af embryo isolation maskinen. Figur 4 viser processen med embryo isolation på inverteret mikroskop. <p class="…

Discussion

Vi udviklede et foster isolation protokol, der er hurtig, effektiv og kan nemt overføres til andre laboratorier.

Den beskrevne udstyr består her af et omvendt mikroskop, en mikromanipulator, glas microcapillaries, en lodret filament aftrækker og en microinjector (figur 3A). Opsætningen ligner den, der er beskrevet for enkelt dyr celleisolering for transcriptomics analyser ^17. Vi har også med succes arbejdet med en mere grundlæggende setup, hvor glas microcap…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
			REAGENTS
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
First- strand buffer	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	contained in Superscript II package
Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		Different suppliers will also work
Thin wall Capillaries 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind tube 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5wells 10 mm diameter slides	Electron Microscopy Sciences	63421-10
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus slide	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
Glycin	Fluka	50050
SDS pellets	Roth	CN30.3
Micro Pestle	VWR	431-0094
Microfine insulin syringes	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
Ethanol	Schaurlau	ET00102500
Forceps N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico Chip	Agilent Technologies	5067-1513
			EQUIPMENT
Inverted microscope	Nikon TMS (Japan),
Micromanipulator	Leitz		Leica
Micomanipulator Post mount LH1 probe	Leica microsystems	39430101	Different brand will also do the work
Vertical filament puller	Sutter instrument	P-20 model	Other model are also suitable
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit Fluorometer	Invitrogen (life technologies