Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em> Arabidopsis thaliana</em> Sementes
Summary
Nós relatamos um método eficiente e simples para isolar os embriões em estágios iniciais de desenvolvimento de<em> Arabidopsis thaliana</em> Sementes. Até 40 embriões podem ser isolados em 1 hora a 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. O procedimento é adequado para transcriptoma, a metilação do DNA, a expressão do gene repórter, imunomarcação e fluorescência<em> In situ</em> Análises de hibridização.
Abstract
Em plantas com flores, o embrião se desenvolve dentro de um tecido nutritivo – o endosperma – cercado pelos tegumentos de sementes maternas (ou tegumento). Como consequência, o isolamento de embriões de plantas em fases iniciais (1 célula para a fase globular) é tecnicamente difícil devido à sua relativa inacessibilidade. Dissecção Manual eficiente em fases iniciais é fortemente prejudicada devido ao pequeno tamanho dos jovens de sementes de Arabidopsis e a adesividade do embrião para os tecidos circundantes. Aqui, nós descrevemos um método que permite o isolamento eficiente de embriões jovens de Arabidopsis, originando até 40 embriões em 1 hora e 4 horas, dependendo da aplicação a jusante. Os embriões são libertados no tampão de isolamento por esmagamento ligeiramente 250-750 sementes com um pilão de plástico num tubo Eppendorf. Um copo microcapilar ligado a qualquer uma pipeta padrão de laboratório (através de um tubo de borracha) ou de um microinjetor controlada hidraulicamente é usado para coletar embriões de lugar gotículasd numa lâmina de multi-poços em um microscópio óptico invertido. As competências técnicas necessárias são simples e facilmente transferível, ea configuração básica não requer equipamento caro. Os embriões recolhidos são apropriados para uma variedade de aplicações a jusante, tais como RT-PCR, o RNA de sequenciação, análise de metilação de ADN, hibridação in situ fluorescente (FISH), a imunocoloração, e ensaios de gene repórter.
Introduction
O embrião de plantas floridas está rodeado pelo endosperma, um tecido nutritivo derivado de um segundo evento de fertilização. Ambos embrião e endosperma está cercado por várias camadas de células do tegumento. Colectivamente estes tecidos formar uma semente, que se desenvolvem no interior do fruto. Assim, tecidos e análises específicas de células de embriões de Arabidopsis são fortemente prejudicada devido a sua inacessibilidade. No entanto, os embriões nas fases de fim de globulares ou mais tarde, são relativamente bem passível de dissecção manual utilizando agulhas finas de tungstênio sob o microscópio estereoscópico, ou com uma ligeira pressão sobre a semente, usando uma pinça para extraí-los. Tais técnicas foram utilizadas com sucesso para transcriptoma ou análises de perfis epigenoma como hibridização microarray, sequenciamento bissulfito, ou RNA seqüência (por exemplo, 1-3). Em contraste, os estudos de embriões no zigoto até a fase globular cedo permanecem tecnicamente desafiador. Até o momento, poucos estudos têm repanálises de transcriptoma orted sobre jovens embriões usando tanto microdissection de captura a laser (LCM) de tecidos embrionários de sementes seções fixas quatro ou extração manual dos embriões individuais a partir de sementes, utilizando ferramentas finas 5. No entanto, o equipamento GCV não é vulgarmente disponíveis e extracção manual do embrião em fases iniciais é demorado e que exige excelentes capacidades de dissecação que não são facilmente transferíveis. Em adição à análise de todo o genoma, em análises de expressão de genes in situ também são difíceis de executar em jovens, conjunto de montagem em embriões de Arabidopsis. Em certa medida, os embriões jovens pode ser libertado em lâminas de microscópio por uma suave pressão sobre as sementes e utilizada para os ensaios de gene repórter ou de detecção de proteínas por coloração imunológica (por exemplo, ver 6,7). Esta técnica, no entanto, não permitir o isolamento de embriões de alto rendimento, impedindo assim as análises quantitativas.
Por isso, desenvolvemos um protocolo eficiente e rápidapara o isolamento de embrião a partir de sementes de Arabidopsis que é simples de configurar, facilmente transferíveis, e apropriado para uma variedade de aplicações a jusante. O princípio básico consiste em triturar suavemente sementes – dissecada jovens siliques em um tubo Eppendorf utilizando um pilão de plástico num tampão de isolamento adequado. O extracto de semente é colocada em gotas sobre uma lâmina de multi-poços e é pesquisado quanto à presença de embriões libertados na fase desejada usando um microscópio invertido. Os embriões são coletados por meio de um vidro microcapilar ligado a um microinjetor ou uma pipeta de laboratório padrão. Para aplicações moleculares, os embriões são lavados duas vezes por libertação repetida em gotas de novo tampão de isolamento antes de transferi-los para o buffer de destino num volume mínimo. Para aplicações citológicos (ensaios repórter, positividade, peixe), as etapas de lavagem pode ser omitido.
O método oferece várias vantagens: (i) produz 25-40 embriões em ~ 45 min para aplicação citológicocações ou em 3-4 hr para aplicações moleculares (incluindo as etapas de lavagem), (ii) que permite o isolamento de estágios embrionários específicas, (iii) é facilmente transferível para outras pessoas e laboratórios, devido à sua configuração simples, (iv) requer equipamento acessível para a configuração básica, que é passível de upgrades, e (v) foi usado com sucesso por várias aplicações a jusante, como RNA seqüenciamento 8, a análise de DNA-metilação-específica gene 9, ensaios repórter (10 e Raissig et al., em prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédito, ver Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Foi desenvolvido um protocolo de isolamento do embrião, que é rápida, eficaz, e pode ser facilmente transferido para outros laboratórios.
O equipamento aqui descrito é composto por um microscópio invertido, um micromanipulador, vidro microcapilares, um puxador de filamento vertical e um microinjector (Figura 3A). A instalação é semelhante à descrita para o isolamento única célula animal para análises transcriptomics 17. Também trabalhou com sucesso c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer Tal Nawy e Martin Bayer para os seus conselhos sobre o isolamento do embrião. MTR, VG, UG e CB inventou o equipamento de isolamento de embriões. MTR, VG e CB desenvolveu o protocolo de isolamento de embriões. MTR, VG e CB estabelecido o protocolo, isolado dos embriões, e embrião gerado cDNA, VG realizada a PCR, MTR a coloração GUS, JJ experimentos os peixes. MTR, VG, CG e UG escreveu o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Zurique, uma bolsa da Fundação Roche Research (a MTR), e doações da Fundação Nacional da Suíça (para UG e CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
References
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