Isolation, behandling og analyse af murine Gingival Cells
Summary
Denne undersøgelse beskriver en effektiv teknik til at isolere og behandle gingivale væv fra muse mundhulen for at producere en enkelt cellekultur. De resulterende celler kan yderligere anvendes til flowcytometrianalyse og molekylære studier.
Abstract
Vi har udviklet en teknik til præcist isolere og behandle murin tandkødsvæv til flowcytometri og molekylære studier. Tandkødet er en unik og vigtig væv at studere immunmekanismer fordi det er involveret i vært immunrespons mod oral biofilm, kan forårsage periodontale sygdomme. Endvidere muliggør den tætte nærhed af gingiva til alveoleknoglen væv også studere knogleremodelleringen under betændelsestilstande. Vores metode giver store mængder af immunceller, der tillader analyse af selv sjældne cellepopulationer, såsom Langerhanske celler og T regulatoriske celler, som vi tidligere vist 1.. Anvender mus at studere lokale immunresponser involveret i alveoleknogletab under parodontose er fordelagtig på grund af tilgængeligheden af forskellige immunologiske og eksperimentelle værktøjer. Alligevel, på grund af deres lille størrelse og relativt ubekvemme adgang til det murine gingiva mange undersøgelser undgås undersøgelse af This kritisk væv. Metoden i dette arbejde kan gøre det lettere gingival analyse som forhåbentlig vil øge vores underdrive den mundtlige immunsystemet og dets rolle under parodontose.
Introduction
Gingiva er det bløde væv omkring den cervikale del af tænderne og dækker den alveolære proces (figur 1). Tandkødet er en type af tyggemæssig slimhinde, som kan adskilles yderligere i slimhindeepitelet og bindevæv (også kendt som submucosa eller lamina propria). Den anatomiske struktur gingiva og tilstødende tænder tillader bakterier at opholde sig og udvikle plak (biofilm), som konstant udfordrer det lokale immunforsvar. Som et resultat, udvikler inflammatorisk respons i tandkødet, som under visse omstændigheder bliver ødelæggende – en tilstand kaldet parodontale sygdomme 2. Grundlæggende kan plak-inducerede periodontale patologier opdeles i tandkødsbetændelse og parodontose. Gingivitis er en reversibel tilstand af lokal inflammatorisk respons, der er begrænset til gingiva. Parodontitis, på den anden side, er en irreversibel destruktiv proces, hvor fastgørelsen apparat (alveoleknoglen, periodontalledbånd, cementum og gingiva), destrueres 3..
Gingiva blev foreslået at tjene både som effektor og induktive sites under parodontose 4.. Humane undersøgelser har antydet, at som svar på plak, immuneffektorceller og molekyler dynamisk infiltreret eller afgang gingiva 5-7. Denne aktivitet blev vist at spille en vigtig rolle i parodontal destruktion 8,9. Betragtninger data genereret af disse undersøgelser, værdifulde oplysninger om denne patologiske proces, der arbejder med humant væv besidder store etiske, tekniske og eksperimenterende begrænsninger. Udviklingen af eksperimentelle modeller tilladt årsag-virknings-eksperimenter via ansætte transgene mus og in vivo interventioner 10. Som følge heraf steg vores viden om de mekanismer, der er involveret i paradentose betydeligt i de seneste to årtier. Selv så, på grund af kompleksiteten af parodontale sygdomme, der eren løbende debat om arten af lokale immunrespons letter vævsødelæggelser. Der er også en mangel i vores forståelse af funktionen af centrale immunceller i gingiva under periodontale sygdomme. Det er derfor vigtigt at undersøge patologiske inflammatoriske begivenheder i målvævet af sygdommen, gingiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maxilla gingivale væv fra en enkelt mus er tilstrækkelige til at analysere sub-populationer af T-og B-lymfocytter, samt deres evne til at udtrykke ekstracellulære og intracellulære molekyler, som vi tidligere beskrevet 1.. Men hvis sjældne cellepopulationer er af interesse (f.eks DCS), anbefales det at samle væv 2-3 mus. Det skal bemærkes, hvis foretrækkes, er det muligt at skrælle både palatinalt og gingival væv og derefter til udskæring af tandkødet (en ændring af trin 1,8-1,9). Det bør også…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (nr. 1418-1411) til AHH og (nr. 1933-1912) til AW, den tyske israelske Foundation for unge efterforskere (GIF Young) til AHH og Dr. I . Cabakoff Research Endowment Fund på Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine til AHH og AW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
