Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells
Summary
Deze studie beschrijft een efficiënte techniek voor het isoleren en verwerken tandvleesweefsels van de muis mondholte om een-celkweek produceren. De resulterende cellen kunnen verder worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse en moleculaire studies.
Abstract
We hebben een techniek nauwkeurig isoleren en te verwerken murine gingivale weefsel voor flowcytometrie en moleculaire studies ontwikkeld. Het tandvlees is een unieke en belangrijke weefsels te immuun mechanismen te bestuderen omdat het betrokken is bij gastheer immuunreactie tegen orale biofilm die parodontale aandoeningen kunnen veroorzaken. Bovendien maakt het mogelijk de nabijheid van het tandvlees te alveolaire botweefsel ook het bestuderen botremodellering onder inflammatoire aandoeningen. Onze methode levert grote hoeveelheid afweercellen dat de analyse van zelfs zeldzame celpopulaties zoals Langerhans cellen en regulatoire T-cellen mogelijk maakt zoals we aangetoond eerder 1. Gebruikmakend muizen plaatselijke immune responsen betrokken alveolair botverlies bij periodontale ziekten te bestuderen is voordelig vanwege de beschikbaarheid van verschillende immunologische en experimentele instrumenten. Omdat echter de kleine omvang en de relatief lastig toegang tot de murine gingiva, vele studies vermeden onderzoek this kritische weefsel. De methode in dit werk beschreven kon tandvlees analyse, die hopelijk zal toenemen onze understatement op de mondelinge immuunsysteem en de rol daarvan bij parodontale aandoeningen te vergemakkelijken.
Introduction
Gingiva het zachte weefsel rond de cervicale gedeelte van de tanden en de alveolaire werkwijze omvat (figuur 1). De gingiva is een soort kauw slijmvlies dat verder kan worden gescheiden in mucosale epitheel en bindweefsel (ook bekend als submucosa of lamina propria). De anatomische structuur van het tandvlees en de aangrenzende tanden laat bacteriën om plaque (biofilm) die voortdurend uitdaagt het lokale immuunsysteem verblijven en te ontwikkelen. Daardoor ontstekingsreactie ontstaat in de gingiva, die onder bepaalde omstandigheden wordt destructief – een voorwaarde genoemd parodontitis 2. In principe kan plaque-geïnduceerde parodontale aandoeningen worden verdeeld in gingivitis en periodontitis. Gingivitis is een reversibele aandoening lokale ontstekingsreactie die wordt beperkt tot de gingiva. Parodontitis, anderzijds, is een onomkeerbaar vernietigingsproces waarbij het bevestigingsinstrument (alveolaire bot, periodontaleligament, cement en tandvlees) wordt vernietigd 3.
De gingiva werd voorgesteld om zowel als effector en inductieve locaties serveren tijdens parodontale aandoeningen 4. Menselijke studies hebben gesuggereerd dat in reactie op tandplaque, immune effector cellen en moleculen dynamisch geïnfiltreerd of vertrek van het tandvlees 5-7. Deze activiteit bleek een belangrijke rol spelen bij parodontitis 8,9. Overwegende dat de gegevens die zijn gegenereerd door deze studies leverden waardevolle informatie met betrekking tot dit pathologisch proces, het werken met menselijke weefsels bezitten belangrijke ethische, technische en experimentele beperkingen. De ontwikkeling van experimentele modellen toegestaan oorzaak-gevolg experimenten via het gebruik van transgene muizen en in vivo interventies 10. Daardoor kennis over de bij parodontitis mechanismen aanzienlijk gedurende de laatste twee decennia. Toch, vanwege de complexiteit van parodontitis, iseen lopende discussie over de aard van de lokale immuunrespons faciliteren weefseldestructie. Er is ook een gebrek aan inzicht in de functie van de centrale immuuncellen in de gingiva tijdens parodontale ziekten. Het is dus essentieel om pathologische inflammatoire gebeurtenissen in het doelweefsel van de ziekte, de gingiva bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maxilla gingivale weefsel van een enkele muis voldoende voor het analyseren van subpopulaties van T-en B-lymfocyten, evenals hun vermogen om extracellulaire en intracellulaire moleculen uitdrukken zoals we eerder beschreven 1. Niettemin, als zeldzame celpopulaties zijn van belang (bijvoorbeeld DC's), is het raadzaam om zwembad weefsels 2-3 muizen. Of: bij voorkeur is het mogelijk om zowel de schil en palatale tandvleesweefsels en vervolgens Snijd de gingiva (een modificatie van stap 1.8-1.9). Ook moet wor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (nr. 1418/11) tot AHH en (nr. 1933/12) aan AW, de Duitse Israëlische Stichting voor jonge onderzoekers (GIF Young) naar AHH, en de Dr I . Cabakoff Onderzoek Endowment Fund aan de Hebreeuwse Universiteit Hadassah-School of Dental Medicine aan AHH en AW.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
