Murine मसूड़ा कोशिकाओं के अलगाव, प्रोसेसिंग और विश्लेषण
Summary
इस अध्ययन के एक एकल कोशिका संस्कृति का निर्माण करने के क्रम में माउस मौखिक गुहा से मसूड़ों के ऊतकों को अलग करने और प्रक्रिया के लिए एक कारगर तकनीक का वर्णन करता है. परिणामस्वरूप कोशिकाओं आगे प्रवाह cytometry विश्लेषण और आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
हम ठीक से अलग करने और प्रवाह cytometry और आणविक अध्ययन के लिए murine मसूड़ों के ऊतकों की प्रक्रिया के लिए एक तकनीक विकसित की है. मसूड़ा यह periodontal रोग का कारण हो सकता है कि मौखिक biofilm के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल है क्योंकि प्रतिरक्षा तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा और महत्वपूर्ण ऊतक है. इसके अलावा, वायुकोशीय हड्डी के ऊतकों को मसूड़ों के करीब निकटता भी भड़काऊ शर्तों के तहत हड्डी remodeling का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. हमारा तरीका है कि हम पहले 1 प्रदर्शन के रूप में इस तरह के Langerhans कोशिकाओं और विनियामक टी कोशिकाओं के रूप में भी दुर्लभ सेल आबादी के विश्लेषण की अनुमति देता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बड़ी राशि अर्जित करता है. Periodontal रोग दौरान वायुकोशीय हड्डी हानि में शामिल स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए रोजगार चूहों क्योंकि विभिन्न प्रतिरक्षाविज्ञानी और प्रयोगात्मक उपकरणों की उपलब्धता के लिए लाभप्रद है. फिर भी, अपने छोटे आकार और murine मसूड़ा को अपेक्षाकृत असुविधाजनक उपयोग के कारण, कई अध्ययनों थी की परीक्षा से परहेजमहत्वपूर्ण ऊतक. इस काम में वर्णित विधि उम्मीद है कि periodontal रोग के दौरान मौखिक प्रतिरक्षा प्रणाली और अपनी भूमिका पर हमारी समझ में वृद्धि होगी जो मसूड़ों का विश्लेषण, सुविधा सकता है.
Introduction
मसूड़े दांतों की ग्रीवा भाग आसपास के कोमल ऊतक है और वायुकोशीय प्रक्रिया (चित्रा 1) शामिल हैं. मसूड़ा आगे mucosal उपकला और संयोजी ऊतक (भी submucosa या लामिना propria के रूप में जाना जाता है) में विभाजित किया जा सकता है कि चबाने का म्यूकोसा का एक प्रकार है. मसूड़ा और आसन्न दांत की शारीरिक संरचना बैक्टीरिया लगातार स्थानीय प्रतिरक्षा प्रणाली को चुनौती दी है कि पट्टिका (biofilm) रहते हैं और विकसित करने के लिए अनुमति देता है. Periodontal रोग 2 करार दिया – एक शर्त नतीजतन, भड़काऊ प्रतिक्रिया कुछ निश्चित परिस्थितियों में विनाशकारी हो जाता है जो मसूड़ा, में विकसित करता है. असल में, पट्टिका प्रेरित periodontal विकृतियों मसूड़े की सूजन और periodontitis में विभाजित किया जा सकता है. जिंजीवाइटिस मसूड़ों तक ही सीमित है कि स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक प्रतिवर्ती हालत का प्रतिनिधित्व करता है. Periodontitis, दूसरे हाथ पर, एक अपरिवर्तनीय विनाशकारी प्रक्रिया है जिसमें लगाव तंत्र (वायुकोशीय हड्डी, periodontalबंधन, दन्त और मसूड़ा) 3 नष्ट हो जाता है.
मसूड़ा periodontal रोग 4 के दौरान के रूप में प्रेरक और प्रेरक दोनों साइटों की सेवा के लिए प्रस्तावित किया गया था. मानव अध्ययन दंत पट्टिका के जवाब में, प्रतिरक्षा effector कोशिकाओं और अणुओं गतिशील घुसपैठ या प्रस्थान मसूड़ा 5-7 कि सुझाव दिया है. इस गतिविधि से periodontal विनाश 8,9 में एक प्रमुख भूमिका निभा दिखाया गया था. मानव ऊतकों के साथ काम कर रहे हैं, इस रोग की प्रक्रिया के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान की उन अध्ययनों द्वारा उत्पन्न डेटा प्रमुख, नैतिक तकनीकी और प्रायोगिक सीमाओं के पास है जबकि. ट्रांसजेनिक चूहों को रोजगार के माध्यम से और इन विवो उपायों 10 में कारण प्रभाव experimentations की अनुमति प्रायोगिक मॉडल का विकास. नतीजतन, periodontal रोग में शामिल तंत्र पर हमारे ज्ञान पिछले दो दशकों के दौरान काफी वृद्धि हुई है. फिर भी, periodontal रोग की जटिलता के कारण, वहाँ हैऊतक विनाश की सुविधा स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रकृति के बारे में एक बहस चल रही है. Periodontal रोग दौरान मसूड़ा में केंद्रीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह पर हमारी समझ में एक कमी भी है. यह रोग, मसूड़े का लक्ष्य ऊतकों में होने वाली रोग भड़काऊ घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इस प्रकार आवश्यक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक माउस से प्राप्त जबडा मसूड़ों के ऊतकों हम पहले 1 वर्णित के रूप में बाह्य और intracellular अणुओं को व्यक्त करने के लिए टी और बी लिम्फोसाइटों के उप आबादी है, साथ ही उनकी क्षमता का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध ऐडवर्ड्स, आह को युवा जांचकर्ताओं (GIF युवा) के लिए जर्मन इजरायल फाउंडेशन, और डा. मैं करने के लिए इसराइल विज्ञान आह को फाउंडेशन (सं 1418-1411) और (सं 1933-1912) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया . आह और ऐडवर्ड्स के लिए डेंटल मेडिसिन के हिब्रू विश्वविद्यालय, Hadassah स्कूल में Cabakoff रिसर्च बंदोबस्ती कोष.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
