تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Summary

الكالسيوم بين الخلايا<sup> 2 +</supهي التي تحرك> موجات عبر قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels. هنا، نحن تصف طريقة لقياس الكالسيوم بين الخلايا^{2 +} موجات في الخلية monolayers في استجابة لحافز الميكانيكية وحيدة الخلية المحلية وتطبيقه على التحقيق في خصائص وتنظيم قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels.

Abstract

الاتصالات بين الخلايا أمر ضروري لتنسيق العمليات الفسيولوجية بين الخلايا في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة، بما في ذلك الدماغ والكبد، شبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية. في إعدادات التجريبية، بين الخلايا كا ^{2 +} موجات يمكن استخلاصها من خلال تطبيق التحفيز الميكانيكي لخلية واحدة. وهذا يؤدي إلى الإفراج عن الجزيئات داخل الخلايا مما يشير IP ₃ والكالسيوم ^{2 +} التي بدء انتشار كا ^{2 +} الموجة بتكثف من الخلية حفز ميكانيكيا إلى الخلايا المجاورة. يتم توفير المسارات الجزيئية الرئيسية التي تتحكم بين الخلايا كا ^{2 +} انتشار الموجة عبر قنوات تقاطع الفجوة من خلال نقل مباشر من IP ₍₃₎ وhemichannels من خلال الافراج عن ATP. ويسمح تحديد وتوصيف خصائص وتنظيم connexin مختلفة والأشكال الإسوية pannexin كقنوات تقاطع الفجوة وhemichannels من قبل quantificatioن من انتشار الكالسيوم بين الخلايا ^{2 +} الموجة، سيرنا، واستخدام مثبطات قنوات تقاطع الفجوة وhemichannels. هنا، نحن تصف طريقة لقياس بين الخلايا كا ^{2 +} الموجة في الطبقات الوحيدة من الخلايا البطانية القرنية الأولية محملة Fluo4-AM ردا على التحفيز الميكانيكي للرقابة والمترجمة استفزاز من قبل، وتشوه قصيرة الأمد الحاد في الخلية نتيجة لذلك من لمس غشاء الخلية مع micropipette الزجاج التي تسيطر عليها مياداة مجهرية التي يبلغ قطرها غيض من أقل من 1 ميكرون. نحن أيضا وصف عزلة الابتدائي الأبقار الخلايا البطانية القرنية واستخدامه كنظام نموذج لتقييم النشاط Cx43-hemichannel باعتبارها القوة يحركها لبين الخلايا كا ^{2 +} موجات من خلال الافراج عن ATP. وأخيرا، نحن مناقشة استخدام، ومزايا والقيود والبدائل لهذا الأسلوب في سياق الفجوة قناة تقاطع والبحوث hemichannel.

Introduction

الاتصالات بين الخلايا وإشارات ضرورية لتنسيق العمليات الفسيولوجية في استجابة لمنبهات خارج الخلية في الأنسجة ^و1،2 مستوى كامل الجهاز. يتم إنشاء الطريق الأكثر مباشرة للاتصال بين الخلايا من حدوث تقاطعات الفجوة. تقاطعات الفجوة هي لويحات من القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي القنوات البروتينية التي شكلتها لرسو السفن وجها لوجه من اثنين connexin (CX) hemichannels من الخلايا المتجاورة ^3،4 (الشكل 1). تقاطعات الفجوة تسمح بمرور الجزيئات الصغيرة إشارة ذات وزن جزيئي أقل من 1.5 كيلو دالتون، بما في ذلك كا ^{2 +} ₃ ⁵ أو IP، مما تسبب في وتحوير كا ^{2 +} الإفراج من المخازن داخل الخلايا من الخلايا المجاورة ⁶ (الشكل 2). قنوات تقاطع الفجوة وينظم بإحكام بواسطة البينية بين الجزيئات والتفاعلات البروتين والعمليات مما يشير الخلوية، مثل تعديل الأكسدة والفسفرة ^7. GJS تسهيل الاستجابة المنسقة من الخلايا متصلة، فيعمل كمادة كيميائية ومخلى الكهربائية. على سبيل المثال، انتشار إمكانات العمل القلب عبر myocytes الأذيني البطيني ويتم بوساطة قنوات GJ المستندة إلى معادل ^85. CXS يكن لديك سوى دور كقنوات تقاطع الفجوة، ولكن أيضا تشكيل hemichannels المفردة، وبالتالي تعمل كقنوات في الأغشية على نحو مماثل لقنوات ايون العادية ^8-10 (الشكل 1). المشاركة Hemichannels في إشارة نظير الصماوي بين الخلايا المجاورة عن طريق التحكم في تبادل الأيونات والجزيئات يشير بين البيئة داخل وخارج الخلية.

في العديد من أنواع الخلايا (مثل الخلايا الظهارية وخلايا بانية للعظم، الخلايا النجمية والخلايا البطانية، وغيرها) وأجهزة (مثل الدماغ والكبد وشبكية العين، القوقعة والأوعية الدموية)، بين الخلايا كا ^{2 +} موجات أساسية لتنسيق الاستجابات المتعددة الخلايا <suP> 11. الزيادات في داخل الخلايا كا ^{2 +} المستويات في خلية معينة لا تقتصر على هذه الخلية، ولكن تنتشر إلى الخلايا المجاورة المحيطة بها، وبالتالي إنشاء الكالسيوم بين الخلايا ^{2 +} الموجة ^12،13. هذه بين الخلايا كا ^{2 +} موجات مهمة لتنظيم فسيولوجية طبيعية من طبقات الخلايا باعتبارها مخلى وارتبط التقلبات مع العمليات الفيزيولوجية المرضية ^11. في بطانة القرنية وظهارة، مجموعات مختلفة ^14-24، بما في ذلك منطقتنا ^25-33، ودرس آليات وأدوار الاتصالات بين الخلايا. في الخلايا غير منفعل، مثل الخلايا البطانية القرنية، واثنين من وسائط مختلفة من الاتصالات بين الخلايا تحدث ^28،29، وهي فجوة التواصل بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي. ينطوي على فجوة الاتصال بين الخلايا صلي على التبادل المباشر للجزيئات إشارة عبر الفجوة التقاطعات ^7. الفجوة و Juncالاتصالات بين الخلايا tional أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة، والسيطرة على تكاثر الخلايا، وإنشاء استجابة المتزامنة للإجهاد خارج الخلية ^10،34،35. في عدد من الحالات المرضية، يتم تقليل الفجوة اقتران تقاطع بسبب CXS المعيبة، والتي تؤثر بهذا الفجوة صلي الاتصالات بين الخلايا ^36. وهذا يؤكد أهمية وتأثير فجوة الاتصال بين الخلايا صلي في الكائنات متعددة الخلايا. وعلى النقيض من فجوة الاتصال بين الخلايا صلي والاتصالات بين الخلايا نظير الصماوي ليست متوقفة على بدل خلية خلية، لأنه ينطوي على الافراج عن رسل خارج الخلية إنتشاري (الشكل 2). يتم إطلاق أنواع مختلفة من الجزيئات يشير في الفضاء خارج الخلية عن طريق إشارات الخلايا. ثم يتم نقل جزيء إلى الخلية المستهدفة حيث يتم الكشف عنها بواسطة بروتين مستقبلات محددة. وفي وقت لاحق مجمع مستقبلات إشارة يؤدي الى استجابة الخلوية، التييتم إنهاء عن طريق إزالة إشارة، تعطيل أو إزالة التحسس. صدر محبة للدهون رسل إشارة خارج الخلية اختراق الغشاء وتعمل على مستقبلات الخلايا. في المقابل، رسل ماء لا عبور الغشاء البلازمي للخلية الاستجابة، ولكن بمثابة يجند التي تربط لسطح أعرب البروتينات المستقبلة، التي تتابع بعد ذلك إشارة إلى البيئة داخل الخلايا. ثلاث عائلات رئيسية من البروتينات مستقبلات سطح الخلية المشاركة في هذه العملية: ايون قناة مرتبطة، المرتبط بالإنزيم، وربط بروتين G. الجزيء رسول صدر يمكن أن تعمل على المستقبلات من نفس الخلية (autocrine)، على الخلايا المستهدفة على مقربة (نظير الصماوي)، أو على الخلايا المستهدفة البعيدة التي تتطلب نظام الدورة الدموية (الغدد الصماء).

في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك بطانة القرنية ^28،29، ATP هو واحد من عوامل نظير الصماوي ماء الرئيسية التي تدفع انتشار بين الخلايا كا ^{2 +} موجات ^37-40. الدرجي تشوه الميكانيكية، نقص الأكسجة، التهاب أو التحفيز من قبل وكلاء مختلف، ATP يمكن أن تنطلق من الخلايا السليمة ^41-44 استجابة لإجهاد القص، وتمتد، أو ناضح تورم ^44،45. وقد افترض آليات ATP-الافراج مختلفة، بما في ذلك إيماس حويصلي ⁴⁴ وعدد كبير من آليات النقل، مثل راديو كاسيت ATP ملزم (ABC) الناقلون، قنوات أنيون التي تعتمد على الجهد البلازمي ^46، P2X7 قنوات مستقبلات ^47،48، وكذلك hemichannels connexin ^49-52 وhemichannels pannexin ^43،49،53. ATP خارج الخلية يمكن ان تحلل بسرعة إلى ADP، AMP والأدينوساين ^54،55 من قبل ectonucleotidases التي تكون موجودة في البيئة خارج الخلية. سوف ATP صدر خارج الخلية والمستقلب ADP ⁵⁶ ينتشر عن طريق نشرها. وقد تورط التفاعل اللاحقة من هذه النيوكليوتيدات مع مستقبلات purinergic في الخلايا المجاورة في عropagation من بين الخلايا كا ^{2 +} موجات ^28،37،51. فئتين مختلفتين من المستقبلات purinergic موجودة: الأدينوزين هو يجند الطبيعية الرئيسية لP1-purinoceptors، في حين أن كلا البيورين (ATP، ADP) وبيريميدين (UTP، UDP) النيوكليوتيدات تعمل على معظم P2-purinoceptors ^57.

الاتصالات بين الخلايا يمكن التحقيق من قبل وسائل مختلفة مثل تحميل كشط، ونقل صبغ، uncaging المحلية من منبهات مثل IP ₃ والكالسيوم ^{2 +،} التحفيز الميكانيكي، الخ. نحن هنا وصف دراسة كا ^{2 +} موجة الانتشار التي تسببها التحفيز الميكانيكي من خلية واحدة. الاستفادة من دراسة كا ^{2 +} انتشار الموجة عن طريق التحفيز الميكانيكي هو أنه يوفر أداة سهلة لقياس انتشار كا ^{2 +} الموجة مع مرور الوقت وأنه يسمح بمقارنة كميا المعالجة المسبقة مختلفة من الخلايا. في بطانة القرنية، وهذه كا ^{2 +} بين الخلايا موجات تسمح لشركةاستجابة منسقة من أحادي الطبقة، وهو يتصرف بموجب كآلية دفاع ممكن من بطانة القرنية غير التجدد مساعدة البطانة على تحمل الضغوط خارج الخلية أثناء الجراحة داخل العين، أو عند التعرض للالتهابات وسطاء خلال الرفض المناعي أو التهاب القزحية ^58،59.

Protocol

1. عزل الخلايا البطانية القرنية قبل الشروع في العمل: عزل الخلايا من العيون العذبة، التي تم الحصول عليها من مسلخ المحلية، في أقرب وقت ممكن بعد enucleating العين. تأكد من أن العين كانت منزوعة النواة من بقرة القصوى 18 شهرا من العمر، خمس دقائق…

Representative Results

يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية واللوائح والوكالات التنظيمية ذات الصلة، ويتم تنفيذ بروتوكول يتم شرحها تحت إشراف وموافقة ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام من جامعة لوفين الكاثوليكية. في الأبقار الخلا?…

Discussion

في هذا المخطوط، ونحن تصف طريقة بسيطة لقياس بين الخلايا كا ^{2 +} انتشار الموجة في الطبقات الوحيدة من الأبقار الخلايا البطانية القرنية الأولية عن طريق توفير التحفيز الميكانيكي المترجمة والتي تسيطر عليها باستخدام micropipette. الخلايا حفز ميكانيكيا الاستجابة مع زيادة ال…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller