सेल monolayers में यांत्रिक उत्तेजना प्रेरित कैल्शियम वेव प्रचार: गोजातीय कॉर्नियल endothelial कोशिकाओं का उदाहरण

Summary

कहनेवाला सीए² तरंगों अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels द्वारा संचालित कर रहे हैं. यहाँ, हम कहनेवाला सीए को मापने के लिए एक विधि का वर्णन² तरंगों एक स्थानीय एकल कोशिका यांत्रिक उत्तेजना और गुण और अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels के नियमन की जांच के लिए अपने आवेदन के जवाब में सेल monolayers में.

Abstract

कहनेवाला संचार मस्तिष्क, जिगर, रेटिना, कोक्लीअ और vasculature सहित अंगों और ऊतकों की एक किस्म में कोशिकाओं के बीच शारीरिक प्रक्रियाओं के समन्वय के लिए आवश्यक है. प्रयोगात्मक सेटिंग्स में, कहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों किसी एकल कक्ष के लिए एक यांत्रिक उत्तेजना को लागू करने से हासिल किया जा सकता है. इस intracellular संकेत आईपी अणुओं ₃ और सीए ² की रिहाई के लिए सुराग ⁺ पड़ोसी कोशिकाओं को यंत्रवत् प्रेरित सेल से ⁺ लहर समकेंद्रिकतापूर्वक ² सीए का प्रचार आरंभ कर. कहनेवाला सीए ^{2 +} लहर प्रसार को नियंत्रित कि मुख्य आणविक रास्ते आई पी ₃ का सीधा हस्तांतरण के माध्यम से और एटीपी की विज्ञप्ति के माध्यम से hemichannels द्वारा अंतराल जंक्शन चैनलों द्वारा प्रदान की जाती हैं. गुण और विभिन्न connexin और अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels रूप pannexin isoforms की नियमन की पहचान और लक्षण वर्णन quantificatio द्वारा अनुमति दी जाती हैएन कहनेवाला सीए ^{2 +} लहर, siRNA, और अंतराल जंक्शन चैनलों और hemichannels की inhibitors का उपयोग के प्रसार की. यहाँ, हम एक परिणाम के रूप में कहनेवाला ² सीए सेल के एक तीव्र, कम से स्थायी विरूपण द्वारा उकसाया एक नियंत्रित और स्थानीय यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में Fluo4-AM के साथ भरी हुई प्राथमिक कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के monolayers में ⁺ लहर को मापने के लिए एक विधि का वर्णन कम से कम 1 माइक्रोन का एक टिप व्यास के साथ एक micromanipulator नियंत्रित कांच micropipette के साथ कोशिका झिल्ली को छूने की. हम भी प्राथमिक गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं और ⁺ लहरों एटीपी की विज्ञप्ति के माध्यम से कहनेवाला ² सीए के लिए प्रेरित बल के रूप में Cx43-hemichannel गतिविधि का आकलन करने के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में इसके उपयोग के अलगाव का वर्णन है. अंत में, हम उपयोग करते हैं, लाभ, सीमाओं और अंतर जंक्शन चैनल और hemichannel अनुसंधान के संदर्भ में इस विधि के विकल्प पर चर्चा की.

Introduction

कहनेवाला संचार और संकेत ऊतक और पूरे अंग स्तर ^1,2 पर कोशिकी एगोनिस्ट के जवाब में शारीरिक प्रक्रियाओं के समन्वय के लिए आवश्यक हैं. कहनेवाला संचार का सबसे सीधा रास्ता अंतराल जंक्शनों की घटना के द्वारा बनाई गई है. गैप जंक्शनों ^3,4 सन्निकट कक्षों के दो connexin (CX) hemichannels (चित्रा 1) के सिर से सिर डॉकिंग द्वारा गठित प्रोटीन चैनल हैं जो अंतराल जंक्शन चैनलों के सजीले टुकड़े हैं, कर रहे हैं. गैप जंक्शनों के कारण और नियमन ² सीए पड़ोसी कोशिकाओं ⁶ (चित्रा 2) के intracellular दुकानों से ⁺ रिहाई., सीए ^{2 +} या आईपी ₃ ⁵ सहित कम से कम 1.5 केडीए के एक आणविक वजन के साथ छोटे संकेतन अणुओं के पारित होने की अनुमति गैप जंक्शन चैनलों कसकर रेडोक्स संशोधन और जैसे, अंतर और आणविक प्रोटीन बातचीत से और सेलुलर संकेत प्रक्रियाओं के द्वारा नियंत्रित किया जाता हैफास्फोरिलीकरण ^7. GJS जिससे एक रासायनिक और बिजली के संकोश के रूप में अभिनय, जुड़े कोशिकाओं के समन्वित प्रतिक्रिया की सुविधा. उदाहरण के लिए, आलिंद और निलय myocytes भर में हृदय की संभावित कार्रवाई का प्रसार CX-आधारित जीजे चैनल ⁸⁵ द्वारा मध्यस्थता है. CXS केवल अंतर जंक्शन चैनल के रूप में एक भूमिका है, लेकिन यह भी unpaired hemichannels फार्म, जिससे नियमित आयन चैनल ^8-10 (चित्रा 1) के लिए इसी तरह की झिल्ली में चैनल के रूप में कार्य नहीं कर रहा. Hemichannels अंतर और बाह्य वातावरण के बीच आयनों और संकेतन अणुओं के आदान प्रदान को नियंत्रित करने से पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच पैराक्राइन संकेतन में भाग लेते हैं.

कई प्रकार की कोशिकाओं (उपकला कोशिकाओं, osteoblastic कोशिकाओं, astrocytes, endothelial कोशिकाओं, आदि की तरह) और अंगों (मस्तिष्क, जिगर, रेटिना, कोक्लीअ और vasculature की तरह) में, कहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों बहुकोशिकीय प्रतिक्रियाओं के समन्वय के लिए मौलिक हैं <suपी> 11. एक निश्चित सेल में intracellular सीए ^{2 +} स्तर में वृद्धि इस सेल तक सीमित है, लेकिन इस तरह एक कहनेवाला सीए ^{2 +} लहर ^12,13 स्थापित करने, आसपास के पड़ोसी की कोशिकाओं के लिए प्रचार नहीं कर रहे हैं. ये कहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों एक संकोश और उनके अनियंत्रण pathophysiological प्रक्रियाओं ¹¹ के साथ संबद्ध किया गया है के रूप में सेल परतों के सामान्य शारीरिक विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कॉर्निया अन्तःचूचुक और उपकला में, हमारे अपने ^25-33 सहित विभिन्न समूहों को ^14-24, कहनेवाला संचार के तंत्र और भूमिकाओं का अध्ययन किया. गैर उत्तेजनीय कोशिकाओं में, कॉर्निया endothelial कोशिकाओं की तरह, कहनेवाला संचार के दो अलग मोड ^28,29, अर्थात् अंतराल junctional कहनेवाला संचार और paracrine कहनेवाला संचार होते हैं. गैप junctional कहनेवाला संचार अंतराल जंक्शनों ⁷ के माध्यम से संकेतन अणुओं का एक सीधा आदान प्रदान शामिल है. गैप Juncराष्ट्रीय कहनेवाला संचार, ऊतक homeostasis को बनाए रखने सेल प्रसार को नियंत्रित करने, और बाह्य तनाव ^10,34,35 को एक सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रिया की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है. विकृतियों के एक नंबर में अंतर जंक्शन युग्मन के कारण दोषपूर्ण CXS करने के लिए कम, और इसके द्वारा अंतराल junctional कहनेवाला संचार ³⁶ प्रभावित हो रहा है. इस बहुकोशिकीय जीव में अंतर junctional कहनेवाला संचार के महत्व और प्रभाव पर जोर दिया. यह प्रसारण कोशिकी दूत (चित्रा 2) की रिहाई शामिल है के बाद से अंतराल junctional कहनेवाला संचार के विपरीत, पैराक्राइन कहनेवाला संचार, सेल सेल समानाधिकरण पर निर्भर नहीं है. संकेतन अणुओं की विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को संकेत द्वारा बाह्य अंतरिक्ष में जारी किया जाता है. अणु तो यह एक विशिष्ट रिसेप्टर प्रोटीन से पता चला है जहां लक्ष्य कक्ष में पहुंचा दिया है. इसके बाद रिसेप्टर संकेत जटिल जो एक सेलुलर प्रतिक्रिया, लातीसंकेत, निष्क्रियता या desensitization के हटाने से समाप्त होता है. विमोचन lipophilic कोशिकी संकेत दूतों झिल्ली घुसना और intracellular रिसेप्टर्स पर काम करते हैं. इसके विपरीत, हाइड्रोफिलिक दूतों जवाब देने सेल के प्लाज्मा झिल्ली को पार नहीं करते, लेकिन फिर इंट्रासेल्युलर पर्यावरण के लिए संकेत रिले जो सतह व्यक्त रिसेप्टर प्रोटीन को बांधता है कि एक ligand के रूप में काम करते हैं. आयन चैनल से जुड़े, एंजाइम से जुड़ी, और जी प्रोटीन से जुड़े: कोशिका की सतह रिसेप्टर प्रोटीन की तीन प्रमुख परिवार इस प्रक्रिया में भाग लेते हैं. जारी दूत अणु करीब निकटता (पैराक्राइन) में लक्ष्य कोशिकाओं पर, एक ही सेल (autocrine) के रिसेप्टर्स पर कार्य कर सकते हैं, या संचार प्रणाली (एंडोक्राइन) की आवश्यकता होती है कि दूर के लक्ष्य कोशिकाओं पर.

कॉर्निया अन्तःचूचुक ^28,29 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं में एटीपी कहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों ^37-40 के प्रसार ड्राइव कि प्रमुख हाइड्रोफिलिक, पैराक्राइन कारकों में से एक है. Durविभिन्न एजेंटों द्वारा आईएनजी यांत्रिक विरूपण, हाइपोक्सिया, सूजन या उत्तेजना, एटीपी कतरनी तनाव, खिंचाव, या आसमाटिक ^44,45 सूजन के जवाब में ^41-44 स्वस्थ कोशिकाओं से जारी किया जा सकता है. अलग एटीपी रिलीज तंत्र कोष्ठकी एक्सोसाइटोसिस ⁴⁴ और ऐसे एटीपी बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों, plasmalemmal वोल्टेज पर निर्भर आयनों चैनल ^46, P2X7 रिसेप्टर चैनलों ^47,48, साथ ही के रूप में परिवहन तंत्र, के एक बहुतायत सहित माने किया गया है connexin hemichannels ^49-52 और pannexin hemichannels ^43,49,53. कोशिकी एटीपी ADP, एएमपी के लिए तेजी से hydrolyzed हो और बाह्य वातावरण में मौजूद हैं कि ectonucleotidases द्वारा ^54,55 adenosine कर सकते हैं. extracellularly जारी एटीपी और उसके metabolite ADP ⁵⁶ प्रसार के माध्यम से फैल जाएगा. पड़ोसी की कोशिकाओं में purinergic रिसेप्टर्स के साथ इन nucleotides के बाद बातचीत पी में फंसा दिया गया हैकहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों ^28,37,51 के ropagation. Purinergic रिसेप्टर्स की दो अलग अलग वर्गों मौजूद हैं: दोनों प्यूरीन (एटीपी, ADP) और pyrimidine (UTP, यूडीपी) न्यूक्लियोटाइड सबसे p2-purinoceptors ⁵⁷ पर कार्रवाई करते हुए एडेनोसाइन, P1-purinoceptors लिए प्रमुख प्राकृतिक ligand है.

कहनेवाला संचार ऐसी परिमार्जन लोडिंग, डाई हस्तांतरण, आईपी ₃ और सीए ^{2 +,} यांत्रिक उत्तेजना, आदि जैसे agonists के स्थानीय uncaging के रूप में विभिन्न तरीकों से जांच की जा सकती है. यहाँ हम ⁺ लहर प्रसार किसी एकल कक्ष के यांत्रिक उत्तेजना से हासिल ² सीए के अध्ययन का वर्णन. यांत्रिक उत्तेजना से सीए ^{2 +} लहर प्रसार का अध्ययन करने का लाभ यह है ⁺ लहर समय के साथ ² सीए के प्रसार यों के लिए एक आसान उपकरण प्रदान करता है और यह मात्रात्मक कोशिकाओं के विभिन्न pretreatments की तुलना करने की अनुमति देता है. कॉर्निया अन्तःचूचुक में, इन कहनेवाला सीए ^{2 +} लहरों एक सह की अनुमतिmonolayer से समन्वित प्रतिक्रिया है, इसके द्वारा अंतःचाक्षुष सर्जरी के दौरान बाह्य तनाव झेलने में अन्तःचूचुक की मदद गैर पुनर्योजी कॉर्निया endothelium के एक संभव सुरक्षा तंत्र के रूप में काम कर रहा है, या प्रतिरक्षा अस्वीकृति या यूवाइटिस ^58,59 दौरान भड़काऊ मध्यस्थों के लिए जोखिम पर.

Protocol

1. कॉर्नियल endothelial कोशिकाओं के अलगाव आरंभ करने से पहले: आंख enucleating के बाद एक स्थानीय कसाईखाना, जितनी जल्दी हो सके से प्राप्त ताजा आँखों से कोशिकाओं को अलग. आँख अधिक से अधिक 18 महीने पुरानी है, पांच मिन?…

Representative Results

सभी प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में क्रियान्वित कर रहे हैं और प्रदर्शन किया जा रहा प्रोटोकॉल यू लोवेन के जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति के मार्?…

Discussion

इस पांडुलिपि में, हम एक micropipette का उपयोग एक स्थानीय और नियंत्रित यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करके प्राथमिक गोजातीय कॉर्निया endothelial कोशिकाओं के monolayers में कहनेवाला सीए ^{2 +} लहर प्रसार को मापने के लिए एक सरल विध?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller