Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Summary

Межклеточной Ca^{2 +}-Волны обусловлено щелевые каналы и полуканалы. Здесь мы описываем метод измерения межклеточных Са^{2 +}-Волн в монослоев клеток в ответ на местные одноклеточные механический стимул и его применение для исследования свойств и регулирование щелевые каналы и полуканалы.

Abstract

Межклеточной коммуникации имеет важное значение для координации физиологических процессов между клетками в различных органах и тканях, в том числе головного мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудов. В экспериментальных условиях, межклеточные Са ^{2 +-волны} могут быть вызваны применением механической стимул к одной ячейке. Это приводит к высвобождению внутриклеточных сигнальных молекул _IP-3 и Са ^{2 +,} которые инициируют распространения Са ^{2 +-волны} концентрически с механически стимулированных ячейки в соседних ячейках. Основные молекулярные пути, которые контролируют межклеточную Ca ^{2 +-волн} предоставляются щелевых каналов, через прямую передачу IP ₃ и полуканалы посредством высвобождения АТФ. Идентификация и характеристика свойств и регулирование различных коннексином и pannexin изоформы, что щелевые каналы и полуканалы допускаются quantificatioн распространения межклеточного Са ^{2 +-волны,} миРНК, а также использование ингибиторов щелевых каналов и полуканалы. Здесь мы опишем метод для измерения межклеточных Ca ^{2 +-волны} в монослоя эндотелия роговицы первичной клетки, нагруженные Fluo4-AM в ответ на контролируемые и локализованные механический стимул спровоцированы острые, кратковременные деформации ячейки в результате прикосновения к клеточной мембране с микроманипулятор-стекло с контролируемым размером микропипетки с наконечником диаметром менее 1 мкм. Мы также описывают выделение первичной бычьей роговицы эндотелиальные клетки и ее использование в качестве модельной системы для оценки Cx43-гемиканала активность в качестве ведомого силу для межклеточных Са ^{2 +-волн} через высвобождение АТФ. Наконец, обсуждается использование, преимущества, ограничения и варианты этого метода в контексте разрыв канал перехода и гемиканала исследований.

Introduction

Межклеточные связи и сигнализации имеют важное значение для координации физиологических процессов в ответ на внеклеточный агонистов на тканевом и оптово-органном уровне ^1,2. Наиболее прямым способом межклеточной коммуникации создается возникновение щелевые контакты. Щелевые контакты являются бляшки каналов щелевых контактов, которые являются белковые каналы, образованные голова к голове стыковка двух коннексином (Cx) полуканалы соседних ячеек ^3,4 (рис. 1). Щелевые соединения для прохода небольших сигнальных молекул с молекулярной массой менее 1,5 кДа, в том числе Са ^{2 +} или ₃ IP ^5, в результате чего и модуляции Са ^{2 +-высвобождения} из внутриклеточных запасов соседних ячеек ⁶ (фиг. 2). Каналов щелевых соединений жестко регулируется по внутри-и межмолекулярных взаимодействий белков и клеточных сигнальных процессах, как изменение и окислительно-восстановительныефосфорилирования ^7. GJS облегчения согласованных действий связанных клеток, тем самым выступая в качестве химических и электрических синцитий. Например, распространение потенциала действия сердца через предсердных и желудочковых миоцитов опосредовано Cx основе каналов ГДж ^85. CxS не только играют роль каналов щелевых контактов, но и формируют непарных полуканалы, тем самым функционируют как каналы в мембранах аналогично регулярных ионных каналов ^8-10 (рис. 1). Полуканалы участвовать в паракринная сигнализации между соседними ячейками, контролируя обмена ионов и сигнальных молекул между внутри-и внеклеточной среде.

Во многих типах клеток (например, эпителиальные клетки, клетки остеобластов, астроциты, эндотелиальные клетки и т.д.) и органов (например, мозга, печени, сетчатки, улитки и сосудистой), межклеточные Са ^{2 +-волны} имеют основополагающее значение для координации многоклеточных ответов <suP> 11. Увеличение внутриклеточного Са ^{2 +} уровня в определенной ячейке не ограничивается этой клетке, но распространяются на окружающие соседние клетки, тем самым создавая межклеточных Са ^{2 +-волны 12,13.} Эти межклеточные Са ^{2 +-волны} имеют важное значение для нормальной физиологической регуляции клеточного слоя, как синцития и их регуляции был связан с патофизиологических процессах ^11. В эндотелий роговицы и эпителия, различные группы ^14-24, в том числе наши собственные ^25-33, изучал механизмы и роли межклеточной коммуникации. В не-возбудимых клеток, как и эндотелиальные клетки роговицы, два различных режима межклеточной коммуникации происходят ^28,29, а именно щелевые межклеточные связи и паракринные межклеточной коммуникации. Межклеточных щелевых контактов, коммуникация предполагает прямого обмена сигнальными молекулами через щелевые контакты ^7. Gap переходаминых межклеточной коммуникации имеет решающее значение для поддержания тканевого гомеостаза, контроле пролиферации клеток, а также создание синхронизированных ответ на внеклеточный стресса ^10,34,35. В ряде патологий, связь щелевых контактов снижается из-за дефектных CxS, и тем самым влияет щелевых межклеточных взаимодействий ^36. Это подчеркивает важность и влияние щелевых межклеточных взаимодействий в многоклеточных организмах. В отличие от щелевых межклеточных коммуникаций, паракринные межклеточной коммуникации не зависит от межклеточной аппозиции, так как он связан с высвобождением диффузии внеклеточных мессенджеров (рис. 2). Различные типы сигнальных молекул высвобождаются во внеклеточном пространстве путем передачи сигналов клетками. Молекула затем транспортируется в клетки-мишени, где он обнаружен конкретный белок рецептора. Впоследствии рецептор-сигнал комплекс индуцирует клеточный ответ, которыйпрекращается путем удаления сигнала, инактивации или десенсибилизации. Выхода липофильных внеклеточной сигнализации посланников проникают в мембрану и действуют на внутриклеточные рецепторы. С другой стороны, гидрофильный посланники не проходят через плазматическую мембрану ответ клетки, но действовать как лиганд, который связывается с поверхностью экспрессированный рецептор белков, которые затем передают сигнал на внутриклеточную среду. Три основных семейств белков клетки поверхностным рецептором участвовать в этом процессе: ионно-канала связаны между собой, энзим-связанного, и протеин-связанные. Выпущен мессенджера молекула может действовать на рецепторы той же клетке (аутокринная) на клетки-мишени в непосредственной близости (паракринная) или на удаленные клетки-мишени, которые требуют системы кровообращения (эндокринной).

Во многих типах клеток, включая эндотелий роговицы ^28,29, АТФ является одним из основных гидрофильными, паракринная факторами, которые определяют распространение межклеточных Са ^{2 +-волны 37-40.} Дурния механической деформации, гипоксия, воспаление или стимуляции различными агентами, АТФ может быть освобожден от здоровых клеток ^41-44 в ответ на напряжение сдвига, растягивать или осмотическое набухание ^44,45. Различные АТФ-релиз механизмов было постулировано, в том числе везикулярный экзоцитоз ⁴⁴ и множество транспортных механизмов, таких как АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеры, плазмалеммы потенциал-зависимых анионных каналов ^46, Р2Х7 рецептора каналов ^47,48, а также коннексином полуканалы ^49-52 и pannexin полуканалы ^43,49,53. Внеклеточного АТФ может быть быстро гидролизуется до АДФ, АМФ и аденозин ^54,55 по ectonucleotidases, которые присутствуют во внеклеточной среде. Внеклеточно выпущен АТФ и АДФ его метаболита ⁵⁶ будет распространяться путем диффузии. Последующее взаимодействие этих нуклеотидов с пуринергической рецепторов в соседних ячейках было вовлечено в рropagation межклеточного Ca ^{2 +-волны 28,37,51.} Два различных классов пуринергической рецепторы присутствуют: аденозин является основным природным лигандом для P1-пуриноцепторов, в то время как пурин (АТФ, АДФ) и пиримидиновые (UTP, UDP) нуклеотидов действовать на наиболее P2-пуриноцепторов ^57.

Межклеточной коммуникации могут быть исследованы различными методами, такими как загрузка путем соскоба перенос красителя, местные uncaging агонистов, как IP ₃ и Ca ^{2 +,} механическое раздражение, и т.д.. Здесь мы опишем изучение Ca ^{2 +-волн} вызванного механической стимуляции одной ячейки. Преимущество изучения Са ^{2 +-волн} при механическом раздражении в том, что он обеспечивает легкий инструмент для количественной оценки распространения Ca ^{2 +-волны} в течение долгого времени, и это позволяет количественно сравнения различных предварительной обработки клеток. В эндотелий роговицы, эти межклеточные Ca ^{2 +-волны} позволяют сотрудничествасогласованный ответ от монослоя, добровольно выступает в качестве возможного механизма защиты нерегенеративная эндотелий роговицы помогают противостоять эндотелий внеклеточный напряжений при внутриглазной хирургии, или под воздействием медиаторов воспаления во время иммунного отторжения или увеит ^58,59.

Protocol

1. Выделение клеток эндотелия роговицы Перед началом работы: Изолировать клеток из свежих глаз, полученных из местных бойню, как можно скорее после энуклеирующий глаз. Убедитесь в том, что глаз был энуклеировали от коровы максимальных 18 месяцев, пять минут после смерти и с…

Representative Results

Все эксперименты выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов и протокола демонстрируется осуществляется под руководством и утверждение содержания и использования животных комитета Католический университет Левена. <p class="jove_con…

Discussion

В этой рукописи, мы опишем простой метод измерения межклеточных Ca ^{2 +-волн} в монослоям первичных бычьих эндотелиальных клеток роговицы путем предоставления локализованных и контролируемой механической стимуляции с помощью микропипетки. Механически стимулированных клетки реаг?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller